SDSの分子篩いの％Cと％Tの関係・終濃度など・試薬計算

今度はじめてSDSの実験をします。
初心者なので予習していても分からないことが多くて困っています。

(1)分子篩いの孔の大きさはアクリルアミドと架橋剤の濃度の和（％T）と、架橋剤の濃度（%C）に影響される。
%Cが一定の時、%Tがあれば孔は小さくなる。
（%Tが一定の時、%Cがあればやはり孔は小さくなるが、これには限界がある）

とあるのですが、なぜ%Cと%Tに影響されるのか。
２行目のどちらがが一定の時、なぜ他方が小さくなるのか。
また、なぜ限界があるのか、それは何の要因か。
教えてください。

(2)１０%アクリルアミドゲル（分離ゲル）
（各stock溶液から必要量を計算しなさい。ただし使用する器具も考慮に入れること。）
H２O・・　ｍｌ
３０%（w/v）アクリルアミド溶液・・１０％
１．５tris-HClbuffer pH8.8・・３７５ｍM
１０%（w/v）SDS溶液・・・０．１%
１０%（w/v）APS溶液・・・０．１%
TEMED・・・０．０７５%

○以上の問題があったとき、総量が不明でも全溶液に対して何ｍｌ必要か算出できるのですか？
○器具を使用するとき、例えば２．９５ｍｌ必要だった場合に、器具はメスフラスコに３ｍｌ入れてそこからマイクロピペットで５０μｍ抜き取るという作成法でもいいのですか？それとも、２ｍｌメスフラスコではかり、あとはマイクロピペットを使用するのですか？それとも、そもそも使用器具としてメスフラスコは使いますか？

(3)試薬作成計算で終濃度とかいてあるのですが、それはどういう意味ですか。
実験途中に濃度が変化するから終濃度なのですか？

No.1 ベストアンサー 回答者： blackdragon 回答日時： 2004/09/01 19:15

（１）%Tと%Cに影響されるのは、網の目の構造を考えてみてください。

%Tは、網目を作っている糸の量、%Cは、その糸がどれだけの個所で結ばれているかということだと考えるといいかもしれません。

２行目、どちらかが上がれば他方が小さくなるとは言っていませんよね？（孔が小さくなると言っているだけ）

%Cの効果に限界がある理由は、%Cは架橋剤であることを考えればわかるでしょう。極端な話、架橋剤ばかりになってしまっては網にならないですよね。

（２）総量は指定されているはずですね。使うゲル板の大きさと、作る枚数によって違うはずですから。器具も考慮にいれるとは、そのことでは？

あと、このような用途の時には、メスフラスコほどの精度は必要とされません。
メスピペットか、ピペットマン（チップ式ピペットマン）などで取ることになるでしょう。
（たとえば2.95mlのときは、P5000(5mlのピペットマン)で取るか、P1000(1mlのピペットマン)で1ml×2＋0.95mlというふうに。また、たとえば14mlの水なら、10mlのメスピペットで10ml+4mlとか。

（３）終濃度と言うのは、調製し終わった溶液中の濃度という意味です。つまりは、いろいろ混ぜ合わせて、混合後の溶液中での濃度ということ。

この回答へのお礼

的確な説明いただいて、ありがとうございました。よく読んで予習を進めようと思います。

お礼日時：2004/09/01 21:07

No.2 回答者： catheter 回答日時： 2004/09/03 00:08

私も数年前に同様なことを疑問に思った１人です。

「SDSの実験」とは、SDS-PAGEのことですか？

（１）については、＃１さんの回答が的を射て、分かりやすいとも思いますので、割愛しますね。

（２）についても同様ですが、
＞○以上の問題があったとき、総量が不明でも全溶液に対して何ｍｌ必要か算出できるのですか？

できないことはないですが、普通は先に量を決めてから調整に入ります。調整後はピペッティングなどで、よく混合させてください。濃度にムラが出来ると泣くに泣けない結果になります。ご存じかもしれませんが、running gel　及びstacking gel　は少し多めに作って、余りを置いておくと固まったかどうかの目安になります。

＞○器具を使用するとき…
各研究室で違うとは思いますが、私の研究室では溶液調整は全行程ピペットマンを使用しています。抜き取る、はあまりお薦めできません。というか、やらない方が良いでしょう。

（３）について。gel作りでは、様々な溶液を加えていくので濃度が変わり…、って、＃１さんと同じ回答です。


SDS-PAGEは、タンパクを少しでも扱う学科や分野にいると必ず一度は目にするような重要な実験方法ですので、「何故その実験をするのか」という目的も踏まえて勉強し、頑張ってくださいね。%T%Cの比率、泳動電流、電圧を自由に操ることができれば問題はないと思います。

ちなみに、ゲルの組成各濃度とかプロトコルは実験書によって微妙に違いますので、混同しないように気をつけて下さい。例えば、各溶液（TEMEDとAPS以外）を混合し終えたあとに、脱気が必要と書いてある本（HP）もあれば、不必要と書いてある本（HP）もあります。

最後に。以上は私の一研究者としての意見ですが、各研究室、各先生での「やり方」というものがありますので、それを一番重要視して頂いて参考にして頂ければ幸いです。

この回答へのお礼

親身な回答どうもありがとうございます！読んでいて改めて実験に対するやる気が湧きました。Bufferの割合がHPで調べてどこも違うので、どうしたものかと思っていましたが「やり方」がやはり違うのですね、納得です。
「何故、実験するか」は本当に重要だけど、調べると非常に奥深いものなのだなと感動します。
励ましていただき、ありがとうございました。がんばります。

お礼日時：2004/09/04 00:18