Light cycler使用時のサンプル添加に関する疑問

SYBR Greenを用いてLight cyclerでリアルタイムPCRを行っています．

キャピラリーにサンプルを添加する際，マスターMixを入れた後にテンプレートを加えるのはなぜでしょうか？

最初（マニュアルをよく読まずに），テンプレートをマスターMixに加えてからキャピラリーに添加し，実験を行いました．しかしマニュアルを見ると別々に入れるようになっており，「最初から混ぜるな」とまで書いてあります．
しかし，普通に考えたら，最初から混ぜておいた方が良いと思いますし，混ぜてから行っても結果に問題はありませんでした（と思いました）．

機器マニュアルにも試薬のマニュアルにも「最初から混ぜるな」と書いてありますが，どこを探しても理由がわかりませんでした．

よろしくお願いします．

No.1 ベストアンサー 回答者： meineko 回答日時： 2004/10/15 17:59

ご使用の試薬は、どのメーカーのなんていうキットでしょう。

テンプレートを後から入れろというのは、一般的に考えると、常温での非特異的な増幅を避けるためでは無いでしょうか。
ただし、多くのキットは、常温でのTaq polymeraseの活性を押さえる工夫（抗体等によって）がしてあって、最初のサイクルの前に、熱による活性化をしてからPCRサイクルを初める様になっている（ホットスタート）ものが多いようです。

キャピラリでのリアルタイムPCRの経験は無いのですが、ホットスタートするようにはできていないのでしょうか？

この回答へのお礼

ありがとうございます．

試薬は，QIAGENのQuantiTect SYBR Green PCR Kitを使っています．
質問文に書き忘れていましたが，このキットはHotStarTaq DNA Polymeraseを用いています．
にも関わらず，テンプレートを最初に混ぜるなと書いてあります．混ぜておいた方がピペッティング誤差が少ないし，簡単だし，早く終わるのに・・・．

素直にマニュアルどおりやれば良いだけなのかもしれませんが，楽したい性質なので・・・・．

ありがとうございました．

お礼日時：2004/10/15 19:12