HeLa細胞のβチューブリンを染色したのですが・・・

HeLa細胞のβチューブリンを免疫蛍光染色で染色したのですが、核以外がべったりと染まりました。コントロールは染まりませんでした。

そこで伺いたいのですが、よく教科書の写真とかで見るような、チューブリンが繊維状や、網目状の染まっている画像を撮るには何かコツ(固定方法など)とかいるのでしょうか？それとも繊維芽細胞とかでやらないとだめなのでしょうか(この細胞を使って染色している人多いような気がしました)？

よろしくお願いします。

No.2 ベストアンサー 回答者： noname#13872 回答日時： 2005/09/06 19:57

普通、細胞の中には重合していない浮遊チュブリンが詰まっており、

そのまま細胞を固定して染色すると浮遊チュブリンがべったり染まってしまいます。
核が抜けているということで、正しい染まり方だと思います。

繊維状の重合チュブリンのみを染色したいのであれば、
細胞を固定する前にTriton-X等の界面活性剤で処理し、
細胞内の浮遊物質を排出してから固定、染色するといいです。

この回答への補足

固定前にTriton-Xをやってみました。

細胞がみごとに縮みました・・・

Triton-X前に何か処理しないといけないのでしょうか？

補足日時：2005/09/07 23:53

この回答へのお礼

大変参考になりました。
浮遊しているのですか・・・明日試してみます。
ありがとうございました。

お礼日時：2005/09/06 20:54

No.3 回答者： fujishiro 回答日時： 2005/09/07 12:22

自分はαのほうですが、染色したことがあります。

PFA固定で0.05%TritonXで可溶化、0.01%tweenで洗浄、一次抗体反応、tweenで洗浄、二次抗体、洗浄、マウントできれいに見えました。
ブロッキングはしませんでした。

この回答へのお礼

大体同じ流れなのですが・・・

あと1時間ほどで実験の結果が出そうです。
今回はメタノール固定をやめてみました。

三度目の正直でだめならまた考えて見ます。

ありがとうございました。

お礼日時：2005/09/07 23:52

No.1 回答者： geneticist12 回答日時： 2005/09/06 11:10

線維芽細胞じゃなければうまくいかないないなんてことはないと思います。

Molecular Probeのカタログなんかみると、いろいろな細胞でチュブリン骨格を染めた写真がでてますし。

固定は何でやっていますか。
材料は違いますが、うちの研究室でやっている人が言うには、メタノール固定だとチュブリンが脱重合状態になってしまうので不可、フォルマリン固定ならOKだそうです。
固定法、浸透化（界面活性剤、アセトンなど）を工夫してみては。

この回答へのお礼

内容が消えてしまったのでもう一度書き込みます。

回答ありがとうございました。
固定は2%PFAと冷メタノールです。その後、TritonXしています。

メタノールをやめて試してみます。

お礼日時：2005/09/07 23:48