DNA断片を1%アガロースゲルで泳動しました。EtBr染色し泳動写真からMarkerとの比較でDNA断片の大まかな濃度が求める方法を教えてください。Marker2を2マイクロリトッル使用。

A 回答 (1件)

DNAに結合するEtBrの量は二本鎖DNAに比例するので


蛍光量はDNA量と比例します。

なのでサンプルと同じ濃さのMARKER2のバンドを探して、
そのバンドのDNA量を調べて求めます。
同じ濃さのものが無ければどのバンドと、どのバンドの間の濃さであるか見て概算します。

スキャナで取り込んでバンドの濃さを調べても出来ると思いますが、目で見て判断したほうが早いです。

マーカーのバンドの濃さの上限下限を超えている場合はDNAの濃さを概算することは難しいと思います。
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QSDS-ゲル電気泳動

SDS-ゲル電気泳動で、サンプル試薬をウェルにアプライするのですが、このサンプル溶液にグリセロールが入っていると実験書に書いてありました。
これは試薬をアプライしたときに試薬が拡散せずに下に落ちていくのに関係しているらしいのですが、これは何故なのか詳しく教えてください。お願いします。

Aベストアンサー

sarurujiさんこんにちは。
簡単に言うと比重の問題です。
SDSでもアガロースでも電気泳動の際にはゲルを泳動用のbuffer中に浸した状態で流しますね。

その際ウエルが解放状態にありますので、当然アプライしたサンプルはbuffer中に
拡散しようとします。グリセロールはこれを防いでくれます。

グリセロール以外にシュクロースなどを用いたりもしますが、用は糖を高濃度で加えて
比重を重くしているわけです。

しかし、サンプルが20とか30とかになると、アプライしている最中に僅かながら拡散が始まったり、
ゲルに浸透し始めてしまうので、大量のサンプルを扱うときはパラフィルムなどの疎水シート上で
グリセロールや泳動用色素とサンプルをミックスして並べてから一気にアプライします。(既にやってるかもしれませんが)

QプラスミドDNAを電気泳動する時と吸光度測定した時との濃度差について。

土壌に含まれる微生物を特定する研究をしており、PCRを行うために細菌よりプラスミドDNAを取り出し、取れたか確認のために電気泳動を行いました。
ゲルは、1%のアガロースゲルを用い、ゲル作成時に使用した溶液と電気泳動の際のバッファー溶液は1×TAEを使用しました。

1ヶ月ほど前にプラスミドDNAを抽出し、電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色、紫外線を当て観察すると、23000bp付近にバンドが確認出来ました。
このときの濃度を吸光光度測定で計測すると、DNAの量は650μg/mlでした。

ところが最近、前回と同じ操作でDNA抽出をしたのですが、今回の場合、電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色をし、紫外線を当て観察すると、前回よりもバンドの蛍光は強くなっていました。
しかし、このときの濃度を吸光光度測定で計測すると、DNAの濃度は200μg/mlまで低くなっていました。

なぜ、このように電気泳動をした時の蛍光が強くなったにもかかわらず、DNAの濃度は下がってしまったのでしょうか?
マーカーの蛍光は、前回と同じように見えました。

また、このサンプルを用いてPCR操作を行う事は出来るのでしょうか?

本を調べ、アルカリや酸で加水分解されると核酸はモノヌクレオチドになり、260nmの吸光度は高分子核酸に比べて10~15%増加するという事は分かったのですが、これが決定的な原因では無いと思います。

原因の予想がつく方がいらっしゃるなら、教えていただけると幸いです。

土壌に含まれる微生物を特定する研究をしており、PCRを行うために細菌よりプラスミドDNAを取り出し、取れたか確認のために電気泳動を行いました。
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1ヶ月ほど前にプラスミドDNAを抽出し、電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色、紫外線を当て観察すると、23000bp付近にバンドが確認出来ました。
このときの濃度を吸光光度測定で計測すると、DNAの量は650μg/mlでした。

ところが...続きを読む

Aベストアンサー

御自分で調べられているように、プラスミドDNAは、閉環状、開環状、直鎖状の形を取りますので、それにより濃度があてにならないと指導教官からアドバイスを貰ったことがあります。
詳しく調べていないので分かりませんが、吸光度測定での濃度と、ラダーとの光り方から推測する濃度が一致しないのもそのためだと思っていました。

また、他の方も回答なさっているように、純度の問題・機器の問題もあると思います。

なので、私は濃度だけで言えばどちらかと言えば、電気泳動から推測される濃度の方をあてにしています。
ラダーとサンプルのアプライ量とバンドの輝き方から推測出来ますので、今後はそちらも見てみてはどうかと思います。

PCRについては、純度の問題もありますが大丈夫だと思います。
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電気泳動の結果と、吸光度測定での濃度に差があるときでも十分使用できています。ただ、DNAのtemplate量が考えにくいだけで…。

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Q電気泳動のゲル

電気泳動の基礎的なことですが,質問させてください.
単純に考えると,電気泳動は電荷を持った粒子に電界中において移動させるものと思っております.このとき粒子が電気泳動する媒体(アクリルアミドゲルなど)は絶縁体なんですか?それとも導体とか電解質とかなんですか?
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Aベストアンサー

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Qアガロースゲル電気泳動で

ちわっす!
答え魔ぽんたくんでっす♪

今日は困ったコトがあって、投稿しました。
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(DNAがすべて、高分子エリアにスメア状バンドとして集まってしまいます)
(T_T)

泳動バッファなどの試薬は調製済みのメーカー製プレミックス品を使っているので、試薬の組成は合ってます。
希釈率にもミスはありませんでした。
この場合、どのような原因が考えられますか?


<条件>
・泳動バッファ(TAEバッファ)
・ゲル(1×TAEバッファでアガロースを溶解した1%ゲル)
・電圧&時間(50v,90分)
・DNA量(100ng,10ng,3ng,1ng,300pg)

Aベストアンサー

3つ可能性をあげます。

1.lambda HindIIIではなく、未消化のlambda DNAを間違えて流した。

2.長期間冷蔵保存されていて、付着末端が水素結合を起こしている。Lambda末端のcos siteでこういう事が起こるのはご存じだと思いますが、ふつうの制限酵素末端でも起こることがあります。→泳動前に50-60℃で3-5分処理。

3.泳動サンプルはちゃんとバッファーされていますか?
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制限酵素消化液などはバッファーされているのでそのまま加えて問題ないですが、バッファーされていないDNAの水溶液に加えると、DNAが変性したり移動度が変わるなど、おかしなことになります。泳動サンプルの希釈にはTEなどを使いましょう。

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米の品種判別実験でDNA抽出精製してからPCRをかけその後電気泳動するのですが、PCRはDNAが複製するんですよね、コレをやり電気泳動をすることで何がわかるのでしょう、また電気泳動は何をするため使われるんでしょうか

Aベストアンサー

例えば、農薬Aに対して、それを分解することで耐性を持つ品種を作るとすると、その品種が農薬A分解酵素を作るようにしてやればいいですよね。
そこで具体的には、農薬A分解酵素をコードした遺伝子を組み込んでやります。

上で組み込まれた遺伝子が増幅するようにプライマーを作ってPCRをすれば、改良された品種ではその部分が増幅されます。これに対して、その他の品種では何も増幅されないか、あるいは非特異的な増幅が起こります。
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Qアガロースゲル電気泳動法

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Aベストアンサー

様々な大きさのDNAが混在しているでしょうから、部分部分に濃いバンドが見えるものの、バンドが連続したラダー状になるんじゃないですかね?なので、目的はわかりませんが、そのままでは解析は難しいかと…。
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Q電気泳動でのバッファー選択

ふと思ったのですが、アガロースゲル電気泳動ではTAEを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動ではTBEを使うのはなぜなのでしょうか?

Aベストアンサー

文意からするとDNAの電気泳動のようなので以下のURLを参考にしてください。
緩衝溶液の種類によって分離能が変わってくるようです。一般的に2種類の緩衝剤を混合して緩衝溶液を調製すると2箇所のpH領域で緩衝能を持ちますが、TAEやTBEの場合、そのような理由では用いられてはおらず、pH調整用に酢酸やホウ酸を加えているのでしょうね。

参考URL:http://bio.takara.co.jp/catalog/qa.asp?ID=53

Qアガロースゲル電気泳動におけるPCR産物バンドの乱れ

 600 bpくらいのDNA配列をPCRで増やし、その産物をPEG沈して精製しているのですが、PCR直後の電気泳動(1.5% TBE gel)では1本のバンドなのですが、PEG沈後の電気泳動では2本になっています。
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 原因についてご存知の方、あるいは同じ経験をされた方、教えてください。

Aベストアンサー

kohitsujikaiさん、こんにちは。

kohitsujikaiさんは、gel厚、緩衝液の量に気を使っておられるのでしょうか?

想像するに以下の条件で泳動していませんか?
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ゲル厚:4mm以上(結構厚めに作成)
緩衝液量:ゲルが沈むくらい(タプタプ?)
染色:後染めで30-60min程

もし、以上の条件で泳動されているならゲルの上面と下面で泳動に差が生じていることが考えられます。
(側面から見るとバンドが斜めになっていて、染色液の浸透が不十分なためバンドの上面側と下面側が染まっている状態です。このため上方から見ると2本のバンドに見える。)

今度、泳動・染色を行ったとき泳動方向にゲルを切断し、側面から観察してみてください。

Q電気泳動の正確さ

電気泳動のことで質問なのですが、電気泳動はどれくらい正確に測ることができるのでしょうか。教えてください。

Aベストアンサー

ゲルの状態(濃度・均一性)によって若干ずれたりしますので、
精度はその時々によって異なる…というのが実感です。

また、ゲルの端と中央で温度差が生じると、サンプルの移動に影響があります(「スマイル」と言われていて、「( 」←こんな感じになります。)
誤差を防ぐためには
・ゆっくりと(50Vで)サンプルを流す、
・両端のレーンはできるならば使わない ほうが良いみたいですね。

QPCR後のアガロースゲル泳動について

PCRで増幅後、確認のためプラスミド精製、エタノール沈殿をしてから、TEに溶解後のサンプルを10μl泳動しました。
泳動後の結果を見てみると、とても発光が薄いバンドが見られました。(バンドが出た位置は大丈夫でした)いつもははっきり見えていたのにと思い、もう一度やってみましたが、結果は同じでした。私の研究室ではEtBrを先に入れてゲルを作っています。なにがいけないのかがわかりません。一緒に入れたDNAマーカーも薄いです。この発光の濃淡はDNA濃度とも関係してくるのでしょうか?わかりにくい質問ですみません。よろしくお願いします。

Aベストアンサー

先染めで薄かったら、そのまま後染めをして見ましょう。
ゲルにいれたEtBr濃度が低かったからとか、EtBrが溶出しているとか(EtBrはDNAと逆向きに流れるので、低分子DNAのほうからEtBrが抜けてしまいます)いった場合にはこれで解決です。

通常、UV照射装置は感度が最高の短波長と、DNAへのダメージが少なく切り出しに適した長波長の切り替えがついています。長波長に切り替わっているとバンドの蛍光強度は低くなります。そうなっていないでしょうか。

>この発光の濃淡はDNA濃度とも関係してくるのでしょうか?わかりにくい質問ですみません。よろしくお願いします。

EtBrの染色強度でDNAの定量をするくらいですから、DNA量(重量)と蛍光強度には正の相関があります。いつも使っているマーカーも薄いとなると別の原因でしょうけれど。


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