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プラスミドのTE(pH8)に対する溶解度は高いんですか?

エタ沈後、エタノールを除去するとプラスミドの沈殿が残りますが、
これをTEに溶かすことがあるんですが、どのようにして溶かしたら
いいんですか?
溶解度が高いんならほっとけばいいと思いますが。
エタ沈はWAKOのエタ沈メイトというキットを使っています。

また、大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付くと思いますが、沈殿後に加えるTEの液料が少ない場合は液に接しない壁面の沈殿はどうやって溶かせばいいですか?
ピペットで落とすしかないんでしょうか?

また、完全に溶解したかどうかはどうやったら確認できますか?
透明になっていれば溶解したということになるんでしょうが。
沈殿自体が見えにくいのでなかなか苦労しています。

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A 回答 (5件)

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。


また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。

2.Mg++が存在するとDNAが非常に溶けにくい塩を作って溶けにくくなります(逆にこれを利用してEtOH沈殿の回収率を高める方法もあります)。これは純水に溶かそうとするときには難儀ですが、TEに溶かすのであればキレートされるのでそれほど問題ではありません。

沈殿を少量の溶媒に溶かすときには、タッピング(チューブの底をはじく)で、溶媒が十分な範囲をなめるようにすると良いでしょう。チューブの性質にもよりますが、沈殿が付いているところは、水はじきが悪くて液が残ります。壁に付いた液が軽くはじいただけできれいに取れるようになったら、溶けていると溶けたと思っていいでしょう。
また、おおよそ10 kb以下の小さなプラスミドならVortexを使ってもかまいません。

この回答への補足

真空乾燥するようにいわれましたが、
やりすぎると溶けにくくなるようですね。
エタノール沈殿にやるんですが、ある程度は真空乾燥しないと
エタノールが残ってしまうんじゃないでしょうか。
残っていると問題がありそうですが。
ピペッティングで完全に取り除くことができればいいんですが、
37℃、室温ですぐに乾燥するものなんでしょうか。

補足日時:2006/07/08 21:51
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少し裏技をしょうかいしましょう。

70%エタチン後70%エタノールを除いてこんど100-95%エタノールを加え遠心してみてください。もういちどエタノールを除き風乾すると乾きやすいです。真空乾燥までする必要はなく、もしするとしたら37度の大腸菌のインキュベーターにでも掘り込んで10分くらいおいとけば大丈夫です。

この回答への補足

37℃に10分入れると乾燥させすぎてまずくないですか?

7エタチン後、上清を取り除いてエタノールで再度遠心するのってめんどくないですか?

乾燥させすぎて解けにくくなるなら
乾燥させない方がいいかもしれないですね。
ピペッティングで丁寧に除去して室温で3分くらい乾燥させたらいいかもしれないですね。

真空乾燥は今ではあまり使わないみたいですね。

補足日時:2006/07/16 16:29
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ピペットで上手に吸い出すか、ピペットチップをつけたアスピレータで吸い取れば、室温で30分、37℃で5~10分もやれば十分です。

チューブの底を指でつまんでしばらく体温で温めるだけでも良いくらいです。逆にそれくらいでアルコールが飛ぶくらいにきれいに上清を吸い取っておかなければ、塩などの不純物もたっぷり残っているわけで。

ちょっと湿っていてもアルコール分は十分に飛んでいますし、少々アルコール分が残っていたとしても、TEに溶かせば後の酵素反応に問題ないくらい希釈されます。

いまだに真空乾燥しているというのは、時代遅れと言って良いと思います(Molecular Cloningの前の版でもすでに、避けるべきと書いてあったような、、、)。

この回答への補足

シークエンス反応後の70%エタチン後、上清を取り除いて真空乾燥させています。真空乾燥後、シークエンス溶液Hi-Di formamideに溶解しています。

補足日時:2006/07/09 01:41
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非常にきれいなDNAは完全に風乾しても、すぐに解けてくれると思います。

しかし大抵はそこまできれいじゃなかったりするのでしばしばかわかしすぎることで解けなくなることがあるようです。沈澱がかろうじてでも見れるようであれば、解けない時は、溶かした時それがぼうじゅんしてきて、透明または半透明なゲル状のものができます。溶液にそのようなものが見えなければ解けていると考えていいでしょう。

エタちん後、70%EtOHであらい、遠心してから70%EtOHを除く時にピペットで完全にとり、すぐに溶かすのが理想的です。そこが幾らか平らな部分があるチューブだとそれがやりやすいです。

>大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付く

ということですが、これも純度などでいくらかちがってきます。エタノールを加えた後5分ぐらい放置すると、より大きいDNAの凝縮が望めますのでそこに落ちてくる可能性が高くなります。
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答えになっているかわかりませんが、



最後に沈殿したDNAのペレットの状態で、解けやすさが変わります。

エタノールを除いた状態で、ペレットは白いと思いますが、これを風乾すると、だんだん半透明になってきます。さらに乾かすと、また白くなります。
 半透明の状態が、一番解けやすいです。
 乾燥が足りなかったり、乾かしすぎたりすると、溶けにくくなります。
 例えば、100mlの大腸菌のカルチャーで、キアゲンのMAXIで調整したペレットなら5分から10分、15分くらいで、半透明になります。最初は、ずっと見ていてください。TE量は、0.2mlくらいで十分だと思います。濃度で、1から3マイクログラム/マイクロリットルになると思います。

その半透明なペレットにTEをかけて、すこしたってから、TEをかけながらチップで擦れば、溶けると思いますよ。完全に溶けたかどうかは、わかりませんが、目で見て変なものが見えなければ、現実的には問題にならないと思います。
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エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
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70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Qエタノール沈澱で、沈澱が出ませんでした。

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Aベストアンサー

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Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

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よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

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>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

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プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

QDNAを室温放置はまずい?

DNAは実験終了後室温、実験台で放置しておくと
どれくらいで駄目になりますか?
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Aベストアンサー

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 私は、フリーザーに保存しています。

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
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Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

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そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

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Q吸光度計を用いたDNAの純度

 吸光度計を用いたDNAの純度は、A260/A280が1.8~2.0で高純度となり、<1.8だとタンパクなどの不純物の存在が考えられると色々な文献で目にします。
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 ちなみに測定値は
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回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

 純粋な物質には、特定の吸収スペクトルがあります。タンパクは280nm、核酸は260nmに極大吸収があり、その波長がよく利用されています。核酸やタンパクに限らず、純粋な物質は、波長の比は一定の値をとります。
 核酸では、260nm/280nmの吸光度の比だけでなく、260/240,260/250,260/270,260/280,・・・・と、純粋であれば、どの波長の吸光度比も一定の値をとります。

 したがって、純粋なDNAの260/280の吸光度比が1.8であれば、「純粋」であることは否定できませんが、保障するものではありません。
 むしろ、1.8であるハズのものが2.0ならば、純粋でない⇒不純物が混在する、と判断できます。

QDNAの濃縮(イソ沈、エタ沈)がうまくいきません

 エタノール固定した動物組織からフェノクロ法でDNAを抽出していますが、最後の濃縮の段階がどうしてもうまくいきません。
 塩(3M酢酸ナトリウムをDNA溶液の1/10量)、共沈剤(ブルーデキストラン)、イソプロまたはエタノールを加えて冷凍庫にいれるとチューブの底にドロンとした粘性の高い塊ができます。この塊はこれまでに凍結サンプルを使った場合も時々できることがありましたが、今回はすべてのサンプルで発生してしまったので非常に参っています。

1点目
 これは一体なんでしょう?PCRがうまくいかないのとBDで色がつくところを見ると糖類と核酸がごちゃまぜになったものかなと思うのですが、この塊からDNAだけをサルベージすることはできないのでしょうか?

2点目
 上述のような状態なので、ためしに上澄み部分だけを別のチューブに移し、ここから回収できないかとさらに溶媒を加えていろいろ試みているうちに液量がものすごく増えてしまいました。溶媒を足すともやもやするのですが、沈殿するまでは至りません。この溶液中に含まれているDNAも回収したいのですが、溶媒に溶けている状態から濃縮することは可能でしょうか?

どなたか良い案(解決法、予防法、ヒントなど)をお持ちの方がいらっしゃいましたら、よろしくご助力ください!

ご回答をお待ちしております。
 

 エタノール固定した動物組織からフェノクロ法でDNAを抽出していますが、最後の濃縮の段階がどうしてもうまくいきません。
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Aベストアンサー

#1です。
どろどろとなっているのは高分子の多糖なのではないかと考えました。
ですので、ゾルあるいはゲル上になっているものを凍結させるのは
それらを結晶化?させる意味合いです。
DNAは比較的容易に水に溶解することがわかっていますので、
凍結融解を行うことは不純物のみを沈殿させることを期待しています。
ただ、糖類の場合は結構水に易溶であったりするので、この方法は
効果的でないかもしれません。

#2にもあるとおりキットがあるなら、そして予算が許すなら
そのほうが時間も短縮できていいと思いますが、キットの各段階が
どのような効果をもたらしているのかを考えながらやらないと、
結局いろいろな面で無駄になるかもしれません。

そういえばかつて酵素抽出を植物から行ったときに、同様の粘性物質で
困ったことがあります。最終的には解決しなかったのですが、
1)イオン交換樹脂あるいはキレート剤を入れる。これは金属イオン等の
分離を行い、粘性物質の形成阻害を期待しました。
2)pHをかえる。
を行ったことがあります。酵素では一般的に、
そういうことがされているみたいですが
効果がありそうであれば、試してみてください。

#1です。
どろどろとなっているのは高分子の多糖なのではないかと考えました。
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そのほうが時間も短縮で...続きを読む

Q抽出DNAの保存

PCRに使用するため臓器から抽出したDNAを4℃で保存中ですが、保存期間はどのくらいまでが限界でしょうか?また、-20℃では保存期間はどのくらいですか?

Aベストアンサー

精製度によると思います。
簡易な方法で粗精製したものだと数週間から数ヶ月で明らかな分解が認められることがありますが(それでもPCRには使えるかもしれませんが)、超遠心法、フェノール抽出を慎重に行う、イオン交換カラムで精製などでnucleaseのコンタミを排除しておけば、数年単位の長期間にわたり4℃で分解なく保存できます。
私は最近、3年以上前にQiagenのDNaesyで精製してそのまま4℃で保存したゲノムDNAを使いましたが、電気泳動像に分解は認められずPCRの増幅も良好でした。

長期保存する場合、注意する点は、溶媒をTEにしておくこと(純水だとpHが酸性に偏るなどが原因で分解が起きやすくなる)、DNA濃度をあまり低くしないことです(たとえば数十ng/uL以上にする、水分子によるアタックを抑えるため)。

-20℃、-80℃などで凍結保存すれば、粗精製のDNAでも半永久的に保存できます。ただし凍結融解で物理的にせん断されてくるので、バックアップとして長期保存する場合はともかく、日常使うサンプルとしては避けたほうがいいでしょう。凍結を防ぐためにエタノールを加えてフリーザーに保存し、使うときになったらエタノール沈殿で回収するというのもいいでしょう。乾燥沈殿で保存するのは、確かに安定ですがゲノムDNAの場合再溶解が困難になるのでやめたほうがいいですね。

精製度によると思います。
簡易な方法で粗精製したものだと数週間から数ヶ月で明らかな分解が認められることがありますが(それでもPCRには使えるかもしれませんが)、超遠心法、フェノール抽出を慎重に行う、イオン交換カラムで精製などでnucleaseのコンタミを排除しておけば、数年単位の長期間にわたり4℃で分解なく保存できます。
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長期保存する場合、注...続きを読む

Qエチジウムブロマイドについて

まったくの初心者なので・・・・・。
泳動後のゲルの染色についてお尋ねしたいのですが、
アガロースゲルでDNAを泳動した後、エチジウムブロマイドで染色しようと思っています。その時のエチジウムブロマイドの適当な濃度と染色時間を知りたいです。本によって濃度が 様々であり 困ってます。
誰か教えて下さい。宜しくお願いします。

Aベストアンサー

kimwipeさんとdora1さんとほぼ同様です。私は後染めですが、EtBrは10mg/mlで遮光室温でストックしており、水200mlに2mlを加えています。別に用事調整ではなく、何度か使いまわしています(捨てるのに手間がかかりますので)。5分程度シェーカーの上で置いて、その後数回水洗いです。写真を撮る場合、キムワイプ等で水気を切ってから撮っています。ただ、すぐに撮るとバックが強く出る感じがあるので、10分程度おいてから撮っています。ただし、置きすぎるとバンドがぼけます。kimwipeさんがおっしゃるとおり、ゲルにあらかじめEtBrを加えておくと、きれいにバンドが染まるし、泳動中にUVで確認できますが、EtBrが陰極か陽極側に(忘れました)寄るので、ゲルの濃度とバンドの位置によってはバンドとバックが重なるかもしれません。

Qプラスミド精製の原理

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原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む


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