HPLCでの分離について

HPLC初心者です。
HPLCでステロイドの分離をしています。カラムはC18で、移動相はACN/H20(40:60)、流速1ml/minです。フラクションを回収し、EIAで測定して溶出時間を調べていますが、最近分離されずに溶出されているようなのです。
カラムを新しくしたり、前処理を変えたりしたのですが改善しません。以前分離できたものもできなくなっています。
どんな理由が考えられるか教えていただける方、よろしくお願いいたします。

No.3 回答者： Peanuts0804 回答日時： 2011/02/27 22:19

以前うまくいってた時と今回とで何か変更点はありませんか？（実際に分析を行っていた担当者やカラムメーカー等）

そのほかに考えられる原因としては水リッチな条件で分析を行ってらっしゃるようですがカラム平衡化や洗浄の工程をきちんととっていますか？

No.2 回答者： MIYD 回答日時： 2007/08/10 21:46

スタンダードが分離されているのでしたら、

HPLCの問題とは考えにくいですね。

前処理というのは、抽出法か何かで、
サンプルだけにしていて、スタンダードにはしていないのでしょうか。
そうでしたら、サンプルとスタンダードを混ぜたものを前処理してから流してみてはいかがでしょうか。

前処理が不適当であったり、使っている不安定な物質が分解していたりすると、
スタンダードも検出できなくなるかもしれません。
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今回の問題はHPLCのトラブルではないと思いますが、
>ポンプは最近業者に見てもらい、メンテナンス済みです。
HPLCは業者がメンテナンスすれば当分大丈夫という機材ではありません。
トラブルがあるときは、自分で流速などを確認する必要があります。

>溶液、メソッドともに以前分離できていたときとまったく同じです。
メソッドは変更履歴を見れば確認できますが、
溶液が全く同じというのはどういうことですか？
同じ操作をしているのに分離できないという問題が起きている以上、
溶液の劣化や蒸発などが起きていないことを示すだけのデータが無ければ、
溶液に問題がある可能性を否定できません。

>チューブを確認
ボトルに挿しているチューブの先端にフィルターをつけている場合、
詰まって流れない場合があります。
誰かがバッファーを流した後に十分洗浄せずに、
チューブ中に塩が析出しているかもしれません。

この回答への補足

ご指摘いただいたように、試料と同様にスタンダードを前処理してやってみようと思います。

また、使用しているHPLCは私一人だけが使用し、他の溶液を流すことはありませんが、溶液の劣化や蒸発が起きていないという保障がなく、チューブ先端のフィルター、ポンプの流速も含めて確認したいと思います。その他何か注意すべき点がありましたらご指摘ください。

初心者で説明不足も多々あったとは思いますが、丁寧な回答ありがとうございました。結果の改善がみられなかった場合、再度質問することがあるかもしれません。そのときはまたよろしくお願いいたします

補足日時：2007/08/11 18:38

No.1 回答者： MIYD 回答日時： 2007/08/08 20:18

何処まで確認が取れているのですか？

質問文では分離されない時にいきなりカラムを交換して、前処理を変えたとしか分かりませんが、
そんな無茶なことはしていませんよね。

スタンダードを流した状態で、
溶液を確認する
メソッドを確認する
ポンプを確認する
チューブを確認する
インジェクターを確認する

などはどのように確認済みですか？

この回答への補足

説明が不十分で申し訳ございません。
スタンダードは分離されます（EIAの結果では、以前ほどはっきりしたピークではありませんが）。そのため、前処理法が原因かと考え、色々試しましたがうまくいきませんでした。ポンプは最近業者に見てもらい、メンテナンス済みです。溶液、メソッドともに以前分離できていたときとまったく同じです。
インジェクターはオートインジェクターですが、異常があるかどうかの確認はできていません。確認方法がありましたら教えてください。また「チューブを確認」するとはどういったことでしょうか？

補足日時：2007/08/08 20:40