SDS-PAGE 移動度について

こんにちは！！
大変初歩的な質問で申し訳ないのですが、ご回答お願いいたします。

大学でタンパク質の精製実験をし、チトクロムCの純度が上がっていくのを確認するためにSDS-PAGEをおこないました。
SDS-PAGEでは、マーカーのRf値と分子量の対数値をプロットしたグラフを作成し、そこから分子量未知の試料の分子量を求めるということは理解しています。

Rf値は、ブロモフェノールブルーの移動度を1とした各試料の相対移動度であるということですが、ブロモフェノールブルーの移動度はどこからわかるのでしょうか。
SDS-PAGEの結果のカラーコピーがあるのですが、これをものさしで測ってやればいいのでしょうか？(>_<)
ご回答お願いします。
あと、試料は、タンパク質精製のいろいろな段階からとったもので3種類あります。これらの試料から、チトクロムCの純度を求めるのですが、これはSDS-PAGEで染色されたすべての部分の総分子量(1)とチトクロムCの分子量(2)をもちいて、
(2)/(1)で求めればいいのでしょうか？

いろいろな文献を読んでもわかりませんでした。
大変初歩的で申し訳ないですが、ご返答よろしくお願いします。

No.1 ベストアンサー 回答者： teru-arai 回答日時： 2008/02/11 15:19

実習みたいな中身だけど、それなら担当教官に訊けば良いと思うが・・・？

>ブロモフェノールブルーの移動度を1とした各試料の相対移動度であるということですが、ブロモフェ
ノールブルーの移動度はどこからわかるのでしょうか。
意味がよくわかりませんが、ブロモフェノールブルーがどれだか解らないのですか？

>SDS-PAGEの結果のカラーコピーがあるのですが、これをものさしで測ってやればいいのでしょうか？
はい、そうです。普通はゲル上端からの距離を測ります。
ところで、バンドには太さがありますね。バンドの上端、真ん中、下端間での距離のうちどこが良いと思
いますか？　全てに当てはまるわけでは無いのですが、下端をおすすめします。なぜかというと、タンパ
ク質量をどんどん増やしてみます。するとバンドはどんどん太くなり、それにつれて、真ん中と上端の位
置はどんどん上がっていきますが、下端の位置はほぼ同じです（かなり大量になるともちろん下がって
きます）。比較的タンパク質量に依らずたいてい同じ位置になるので（ときどきあれ？というのはあるの
ですが）、下端が一番おすすめです。

>タンパク質精製のいろいろな段階からとったもので3種類あります。これらの試料から、チトクロムCの
純度を求めるのですが、これはSDS-PAGEで染色されたすべての部分の総分子量(1)とチトクロムC
の分子量(2)をもちいて, (2)/(1)で求めればいいのでしょうか？
全然違います。どのくらい純度があるかというのですから、チトクロムCのタンパク質量（重さ、つまり単
位はｍｇとか）/全タンパク質量（チトクロムCの量+それ以外のタンパク質量）、これが純度です。
　しかし、ゲルの中のタンパク質の量を重さで求めるのは無理があるので、タンパク質量と染色の濃さ
は比例し、かつ全てのタンパク質で比例常数は同じと仮定します。つまり、どのタンパク質のバンドで
あっても、バンドの染色の濃さをそのタンパク質の量としてしまうと言う意味です。 従ってスキャンイングのパ
ターンが必要になります。そこから、足し算、割り算をしてください。

この回答へのお礼

teru-arai様
早速のお返事ありがとうございました。
とても詳しくご教示くださり、ありがとうございます。

>ブロモフェノールブルーの移動度を1とした各試料の相対移動度であるということですが、ブロモフェ
ノールブルーの移動度はどこからわかるのでしょうか。
意味がよくわかりませんが、ブロモフェノールブルーがどれだか解らないのですか？

はい、ブロモフェノールブルーがどれだかわからないです・・・マーカーと試料123の結果しかないのですが、どこをみればわかるのでしょうか。すいません。。。

他は理解できました。
確かに、担当教員の方にきくべきでしたが、勉強不足だったので、実習中に聞くことが出来ませんでした。担当されている先生はご多忙なため、締め切りまでに会うことができません。
こちらの勉強不足を大変反省しております。
ありがとうございました。
重ねて恐縮ですが、上の質問について、できればご返答くださるとうれしいです。

お礼日時：2008/02/11 16:42

No.5 回答者： teru-arai 回答日時： 2008/02/12 01:33

>はい、ブロモフェノールブルーがどれだかわからないです

　ブロモフェノールブルーは、泳動の先端付近にあります。青い（青紫か）色素ですけど、どれだか解らないの
じゃなくて、無いのですか。　
無いのは二つの理由が考えられます。
一つはNo2さんが書かれてますが、泳動時間が長すぎて、ゲルの外へ出てしまった場合。
二つめはBPBは割と簡単に拡散するので、ゲルの染色脱色中に見えなくなってしまうこともあります。こ
の場合は、泳動の先端が解るのでそこを使えばいいと思いますが、慣れてないと難しいか・・。

解らないときの処置。普通、ゲルの両端のレーンの泳動は少し遅れますが、内側の他のレーンは皆ほぼ同
じように動いており、内側のレーンのBPBの泳動位置は皆ほぼ同じに成ることが多いです。つまり、分母は
皆同じという意味です。

この回答へのお礼

teru-arai様

再度アドバイスいただき、本当にありがとうございました。
ようやく、理解が深まってきました。
ご指摘の通り、結果を見てみると、泳動先端の位置が大体わかりました。すごくうれしかったです。

今回は私の勉強不足のために、これほどたくさんのかたにお助けいただきました。
よく復習して、しっかりと身につけたいと思います。
ありがとうございました！

お礼日時：2008/02/14 04:29

No.4 回答者： naonao0088 回答日時： 2008/02/12 00:33

RF値は、定規などで測って求めればいいんですよ。

もしかして、泳動先端がどこか分からないということですか？
サンプルを何種類か流しているようですが、一番下に全て同じように濃いバンドが見えると思います。ゲルの上端から、この泳動先端までの長さで、ゲル上端から各バンドの長さを割ればいいんですよ。
参考になったでしょうか。
頑張ってください。

この回答へのお礼

naonao0088様

ご回答ありがとうございました！

結果をみると、何らかの原因でBPBの泳動先端が見えなくなっていました。それで泳動先端がどれなのかわかりませんでした。
しかし、やっとSDS-PAGEについて理解が深まってきました。
問題に付き合ってくださって、本当にありがとうございました。

お礼日時：2008/02/14 04:22

No.3 回答者： asa1201 回答日時： 2008/02/11 23:11

移動度は物差しかなんかで計ればいいのでは？

バンドがいっぱい＝いろんなモンが入っている
バンドが１つ＝一つのものしか入ってない＝純度高い
て感じじゃないでしょうか？

この回答へのお礼

asa1201様

ご回答ありがとうございました！
移動度はものさしで測ればいいと伺って、安心しました。

純度について、確かにバンドの数を見比べることで純度の大小が推定でき、バンドの位置によって分子量もある程度推定できることはわかったのですが、今回の実験では実際に純度を計算しなければならないので困っていました。

とても基本的なことを質問させていただき、大変恐縮でしたが、お答えいただきありがとうございました。

お礼日時：2008/02/14 01:44

No.2 回答者： xen1234 回答日時： 2008/02/11 18:51

そもそも、ブロモフェノールブルーとは何かわかりますか？実験方法とかをよく見てください。

サンプルが青色であったと思いますが、その青色の色素がブロモフェノールブルーです。
この色素はサンプルをアプライするときにわかりやすいとか、電気泳動がどのくらい進行したかということを目的に入れてあります。

ゆえに、電気泳動したゲルの一番下にある青いラインがブロモフェノールブルーです。
時々、時間を長く泳動した場合はその色素がゲルから流れてしまって無くなることもありますが。

もう少し、実験の内容とやっている意味を把握することが大事です。
このままでは全く実験をやっている意味がありません。

頑張ってください。

この回答へのお礼

xent234様
ご教示ありがとうございました！
結果では、ブロモフェノールブルーの青いラインは見えない状態になっていましたが、xent234様のご返事を読んで、やっと疑問が解けました。

今回の実験に関しては、私も勉強不足を強く感じております。申し訳ありませんでした。
それにも関らず、教えてくださってありがとうございました。

お礼日時：2008/02/11 19:26