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レンチウイルスベクターを用いて遺伝し導入し,ある遺伝子の定常発現細胞株を作っています。実験自体は簡単ですから何の問題もないのですが,レンチに関する知識についての質問です。

非常に高い発現量を確保できるレンチウイルスベクターですが,なぜ高い発現量が安定に出し得るのでしょうか?一般的にレンチウイルスベクターでは1-2コピーしかゲノムに組み込まれないとされているのですが,Lipo系のtransfectionをして得られたstable細胞株よりも発現量は高いですよね?

このことについて何か情報・詳しい文献はありませんか?また,レンチウイルスベクターでの遺伝子導入は本当に1-2コピーしか入らないものなのでしょうか?そこも通説として聞いているだけで,実際に文献は読んだことがないので・・・
みなさまよろしくお願いします。

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A 回答 (1件)

>非常に高い発現量を確保できるレンチウイルスベクターですが,なぜ高い発現量が安定に出し得るのでしょうか?


>Lipo系のtransfectionをして得られたstable細胞株よりも発現量は高いですよね?

細胞への遺伝子導入方法は多々ありますが、私の経験から申し上げて、
上記のことについて私は一般的であると思いません。

質問者さんが、もしそう感じていらっしゃるのであればそれはレンチウイルスベクターの次の特性がそう思わせているのかもしれません。

1、分裂していない細胞でも導入可能である
レンチウイルスベクターはHIVをもとにして設計されたシュードタイプのウイルスであり、
他のレトロウイルスは分裂した細胞のゲノム組み込まれやすいのに対して、分裂をしていない細胞のゲノムへの導入が可能です。

2、遺伝子はゲノムに組み込まれる(プロウイルスになる)
レトロウイルスとレンチウイルスではゲノムに組み込まれます。
アデノウイルスベクターではゲノムに導入されません。
また、リポフェクタミン等での遺伝子導入では、ゲノムへの導入は偶然に近いものがあります。

そういう意味で、レンチウイルスベクターでは、多くの細胞でゲノムへの遺伝子導入の確率が高いため、高発現であると質問者さんはかんじているのかもしれません。

しかし、私の経験では、それはあくまで汎用性が高いということであって、すべての遺伝子、すべての細胞において高発現になるとは限らないと思います。
細胞によっては他のレトロウイルスのほうがいい場合もあります。
また、リポフェクタミン等で遺伝子導入した細胞から、遺伝子によってはレンチウイルスベクターより高発現の細胞を単離することは、問題なくできます。
しかし、クローニングに時間がかかることと、遺伝子によっては細胞が増えてこない等の問題が出やすい時もあります。

>レンチウイルスベクターでの遺伝子導入は本当に1-2コピーしか>入らないものなのでしょうか?

私はそう聞いたことがありません。必ずしもそうではないと思いますが・・・。詳しい出典とかは私も知りません。

この回答への補足

どうもありがとうございます。
ご指摘の通り、一般的というのは言いすぎですね。失礼しました。

>そういう意味で、レンチウイルスベクターでは、多くの細胞でゲノムへの遺伝子導入の確率が高いため、高発現であると質問者さんはかんじているのかもしれません。
数種類の細胞株で試しましたが、リポフェクタミンやfugeneでtransfectionし、single cell cloningで最も発現量の高いものをセレクションしたとしても、いずれの場合においてもレンチウイルスベクターを用いて感染させたbulkの細胞の方が、発現量は高いです。single cell clone(導入確率100%)よりも強いので、確率的な要素では無い様に思います。当然promoterは同じものです。

>また、リポフェクタミン等で遺伝子導入した細胞から、遺伝子によってはレンチウイルスベクターより高発現の細胞を単離することは、問題なくできます。
そういう例もあるんですね。導入する遺伝子によるものなのでしょうか。

>リポフェクタミン等での遺伝子導入では、ゲノムへの導入は偶然に近い
ええ、昔はstable lineを作るといえば本当に力仕事でした。

補足日時:2008/02/28 20:27
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Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Qウイルスの力価(titer)とは?

ある本を読んでいて「感染者でウイルスの力価が低い」というような記述があったのですが、ウイルスの力価とはどうゆう指標なのでしょうか?
また、力価が低い場合どうゆう意味なのでしょうか?

教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

 具体的にどうやって力価を測定するか説明した方が判りやすいでしょう。

 まず、検体(ウイルスが含まれる液体)を段階希釈します。2倍ずつ段階希釈すると2倍、4倍、8倍、16倍・・・に希釈されたウイルス液ができることになります。10倍ずつなら10倍、100倍、1000倍、10000倍・・・ということになります。

 そしてそれらのウイルス液を、そのウイルスに感受性を持っている(そのウイルスが感染することができる)モノに感染させます。それは培養細胞だったり発育鶏卵だったりします。

 その後、ある一定の期間後にその細胞なり発育鶏卵が「ウイルスに感染しているかどうか」を調べます。
 何をもって「ウイルスが感染しているか」判断するのは、測定方法によりいろいろあるのですが、最も単純な細胞変性効果(CPE)を指標とするのでしたら、判定は細胞を顕微鏡で観察してCPEが起きているかどうかを見るだけです。

 で、最終的には「どの希釈濃度まで"感染"することができたか」という数字がそのウイルスの力価となります。
 その数字の出し方や単位は、ウイルスや手法によっていろいろあります。1つのウイルスでもいろいろな方法で力価を測定できますし。

 例えば、インフルエンザウイルスの力価を測定する方法を2つ挙げてみます。

 1つはこのウイルスが持つ「赤血球凝集能」を利用する方法で、ウイルス液を2段階希釈した液を鶏の赤血球と反応させます。
 例えば64倍希釈した液までが赤血球を凝集し、128倍では凝集しなかった場合、このウイルスの力価は「64単位」という言い方をします。
 この手法(HA法)は、反応時間が1時間ほどと短く、反応させる赤血球もラボで採血用の鶏を飼っていれば採血~赤血球調整まで1時間もあればできてしまうので、たいへん手軽に実施可能です。
 インフルエンザウイルス以外にも赤血球凝集能を持つウイルスはけっこうあるので、比較的多用される力価測定法です。ただ、赤血球ならなんでも良いというわけではなく、「豚の赤血球」でなければならないとか「ヒトのO型の赤血球」とか、ウイルスによっていろいろです。どこまで本当か判りませんが、「鶏ではダメだけど烏骨鶏の赤血球ならうまくいく」みたいなものもあって、変わった動物の赤血球に凝集能を持つウイルスを分離した時は、採血する動物を探すのに苦労します。その動物を飼っているヒトや施設が見つかっても、血液が欲しい理由を説明するのに苦労したりして。(どう説明しても、その動物そのものを検査されると勘違いされてしまう)

 また、インフルエンザウイルスは犬の腎臓細胞に感染能を持っています。この犬の腎臓細胞は"株化"されているものなので、つまり市販されています。
 この犬の腎細胞を培養し、それに10段階希釈したウイルスを感染させ、1週間ほど培養してCPE(細胞変性)が起きているか確認する方法もあります。

 この場合、1種の希釈ウイルス液を4本の試験管(培養細胞)に感染させたとして、10000倍希釈のウイルス液が4本中2本の細胞を変性させたとすると、力価は「10^4TCID50/25uL」という表記になります。これは「10の4乗まで酌したウイルスが50%の細胞に感染した」という意味です。/25uLというのは、96穴プレートで試験する場合は、たいてい1wellあたり25uL(マイクロリットル)のウイルス液を接種するからです。
 上では「試験管」と書きましたが、現在ではたいてい96個の穴(well)が開いたプレートを使います。私が初めてウイルスを習った先生は「対トレーションは試験管でやらねばならぬ!」という信念の人でしたが・・・

 同様にインフルエンザウイルスは発育鶏卵(胎仔がいる受精卵です)にも感染するので、やはり10段階希釈したウイルスを9~11日齢の発育鶏卵の尿腔膜内に接種する方法もあります。判定方法は基本は細胞と同じなのですが、鶏胚が死滅するのを見るのか尿腔液を回収してHAの有無を見るのかといったところです。
 この場合、単位はEID50を使います。「50%の卵に感染する」という意味合いです。
 ちなみに細かいことですが、TCID50もEID50も"50"は下付き文字で表記します。

 細胞の場合、ウイルスによって感受性細胞は異なりますので、ウイルスの検査機関では常に10-20種類の細胞を培養しています。
 株化細胞であれば「買える」のでいいのですが、ウイルスには"初代培養細胞"でないと感染しないものもあります。まあノーマルでは細胞は元の臓器から培養するとせいぜい数代しか保たないのですが、「異常を来して半永久的に継代可能になった細胞」が"株化細胞"です。
 初代培養細胞でないと増えてくれないウイルスも多々あるため、この初代培養細胞は基本的に自分で作るしかないので苦労することになります。
 なのでたまに「妊娠した牛の新鮮な死体」などが手に入ると、いそいそと胎仔を取り出して細胞を作るというわけです。中にはすごくレアな「羊の胎仔肺細胞」なんて細胞を持っている人がいたりして、私がさんざ苦労して分離できなかったウイルスをその人がそのレアな細胞であっさり分離してしまったりすると、ちょっと悔しかったりします。
(ちなみにここで言う「分離」と力価測定は作業的にはほぼ同じです)

 このように、いわばウイルスの力価とは「結果論」なんです。
 「このウイルスはVero細胞で10^4TCID50/25uLの力価だった」という場合、この数字は"このVero細胞との組み合わせ"でしか通用しません。同じウイルスをMDCK細胞に接種すれば10^2しか出ないかもしれませんし、逆に10^8くらい出てしまうかもしれません。
 また、同じVero細胞であってもAというラボとBというラボで培養されているVero細胞が「同じもの」である保証もあまりないです。元は同じ細胞でも、それぞれのラボで何代も何代も継代されていくうち、「別物」になってしまうことはよくありますから。
 また、あるラボで培養されている細胞が、新たにあるウイルスに対する感受性を獲得することもよくあります。そうなるとその細胞は例えば"Vero-Jagar細胞"というように新たに名前が付けられて株化される、というわけです。
 そうすると今まで力価測定が不可能だったウイルスが可能になるわけです。

 つまりNo.2さんの回答に付け加えるなら、「その細胞がそのウイルスに対する感受性が低い」という要因もあるわけです。
 例えばコロナウイルスなど、患者の便中にはけたたましい量のウイルスが存在するのですが、「力価を測定」するとロクな数字が出ません。ノロウイルスに至っては未だ感受性細胞が見つかっていないため、力価測定不能ですし。つまり言い方を変えると、どんな系で試験しても「力価ゼロ」という結果しか得られないわけです。
 「力価は結果論」というのはそういう意味合いです。

 具体的にどうやって力価を測定するか説明した方が判りやすいでしょう。

 まず、検体(ウイルスが含まれる液体)を段階希釈します。2倍ずつ段階希釈すると2倍、4倍、8倍、16倍・・・に希釈されたウイルス液ができることになります。10倍ずつなら10倍、100倍、1000倍、10000倍・・・ということになります。

 そしてそれらのウイルス液を、そのウイルスに感受性を持っている(そのウイルスが感染することができる)モノに感染させます。それは培養細胞だったり発育鶏卵だったりします。

 その後、あ...続きを読む

Qエクセルで計算すると2.43E-19などと表示される。Eとは何ですか?

よろしくお願いします。
エクセルの回帰分析をすると有意水準で2.43E-19などと表示されますが
Eとは何でしょうか?

また、回帰分析の数字の意味が良く分からないのですが、
皆さんは独学されましたか?それとも講座などをうけたのでしょうか?

回帰分析でR2(決定係数)しかみていないのですが
どうすれば回帰分析が分かるようになるのでしょうか?
本を読んだのですがいまいち難しくて分かりません。
教えてください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるための指数表記のことですよ。
・よって、『2.43E-19』とは?
 2.43×1/(10の19乗)で、
 2.43×1/10000000000000000000となり、
 2.43×0.0000000000000000001だから、
 0.000000000000000000243という数値を意味します。

補足:
・E+数値は 10、100、1000 という大きい数を表します。
・E-数値は 0.1、0.01、0.001 という小さい数を表します。
・数学では『2.43×10』の次に、小さい数字で上に『19』と表示します。→http://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%8C%87%E6%95%B0%E8%A1%A8%E8%A8%98
・最後に『回帰分析』とは何?下の『参考URL』をどうぞ。→『数学』カテゴリで質問してみては?

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/%E5%9B%9E%E5%B8%B0%E5%88%86%E6%9E%90

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるた...続きを読む

Q平滑化;klenowかT4DNA polymeraseか

宜しくお願いします。
ライゲーションを目的として、2本鎖DNAを平滑化する場合、成書にはクレノーを用いた例が殆どですが、なぜT4DNA polymeraseが第一選択ではないのでしょうか?
以前から疑問だったのですが、この度質問するにあたり、複数の業者に問い合わせてみたところ、クレノーはfill inと同時に1塩基される為不向きなので、T4DNA polymeraseを用いて下さいとの回答でした。
それならば何故、教科書にはクレノーの例ばかりなのでしょうか。勿論クレノーを用いても平滑化が可能な事は、理解出来ますが、第一選択としては、T4DNA polymeraseの強力なエキソヌクレアーゼを考慮したとしても、こちらの方が良いと思われるのですが。
上記の様な理由を、どなたかご存知でしたら教えていただければありがたく思います。

Aベストアンサー

まあ用途(polish活性も必要かなど)と用法が間違っていなければどちらを使ってもちゃんと出来るんですけれど。Klenowがfirst choiceになっている成書が多いのはどうしてかという質問に答えるなら、前期のような回答になります。

>↑これですが、失活させるには激しいボルテックスを行う、と説明書にありますが、

説明書にあるならそれでもいいのでしょうけれど、あまり一般的とは言えませんね。フェノールをぶち込んで反応を止めろというのは確かTakaraのkitがそうなっていたと思います。加熱(70℃前後)で止めるというのも割と一般的なようですが、先に書いたようにフェノールが安全だと思います。

>↑温度を下げた場合、T4およびクレノーの反応時間は何分位でしょうか。またdNTPは、標準でもかなり濃いですが、更に2倍3倍入れるという事ですか。入れすぎて問題は無いのでしょうが、どれくらい入れたら良いのでしょうか。

Molecular Cloningによると、T4は100 uM dNTP, 12℃, 15 min、Klenowは50 uM dNTP, r.t., 15 minです。

通常の実験スケールだと酵素過剰になって失敗することが多いので注意です。5 ug以下のDNA量なら通常1 unitもあれば十分です(キットを使うと少量のDNAには酵素が多すぎる場合がある)。DNA量に対して酵素量が多い場合は反応時間はもっと短くていいかもしれません。
Taq polなどと違って、dNTPの濃度は高すぎても問題ないと思います。
ただ、上記の濃度は上記の反応条件の場合ならということで、たとえば反応時間を延ばしたりすると、dNTPがどんどんdNMPに分解されて濃度が下がってきて、削れこみ反応がおこりやすくなる可能性はあります。

>1個人の、1研究室の意見より、メーカーの答えは遥かに信用出来ると思われるんですけどねえ。。

>>これは、いろいろな成書の記載や、経験上からも非常に疑問がある見解だと思います。

と書いたように、決して一個人の意見というのではなく、数々の成書や参考文献から学び、実際にやってみてきたことです。

メーカーの情報も役立ちますが、ちゃんと根拠になる文献がトレースできる実験書(たとえばMolecular Cloning)をそばに置いておくことをおすすめします。

先にも書いたように、Klenowに一塩基付加の活性があるという文献はあります。しかし、だからbluntingにはKenowよりT4 polのほうが優れているということを実際比べてみているわけでもないし、結論わけでもないです。なのにメーカーがそういうことを言っているというのがうさんくさいと思うわけで。

まあ用途(polish活性も必要かなど)と用法が間違っていなければどちらを使ってもちゃんと出来るんですけれど。Klenowがfirst choiceになっている成書が多いのはどうしてかという質問に答えるなら、前期のような回答になります。

>↑これですが、失活させるには激しいボルテックスを行う、と説明書にありますが、

説明書にあるならそれでもいいのでしょうけれど、あまり一般的とは言えませんね。フェノールをぶち込んで反応を止めろというのは確かTakaraのkitがそうなっていたと思います。加熱(70℃前後)で...続きを読む

Q相関係数についてくるP値とは何ですか?

相関係数についてくるP値の意味がわかりません。

r=0.90 (P<0.001)

P=0.05で相関がない

という表現は何を意味しているのでしょうか?
またMS Excelを使ってのP値の計算方法を教えてください。

よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

pは確率(probability)のpです。全く相関のない数字を組み合わせたときにそのr値が出る確率をあらわしています。

統計・確率には100%言い切れることはまずありません。というか100%言い切れるのなら統計・確率を使う必要は有りません。
例えばサイコロを5回振って全て同じ目が出る確率は0.08%です。そんな時、そのサイコロを不良品(イカサマ?)と結論つけるとわずかに間違っている可能性が残っています。ただ、それが5%以下ならp=0.05でそのサイコロは正常ではないと結論付けます。
それが危険率です。(この場合はp=0.1%でもいいと思いますが)
相関係数においても相関の有無を結論つけるにはそのrが偶然出る確率を出すか、5%の確率ならrがどれぐらいの値が出るかを知っておく必要が有ります。

>r=0.90 (P<0.001)

相関係数は0.90と計算された。相関がないのに偶然r=0.90 となる確率は0.001以下だと言ってます。

>P=0.05で相関がない

相関がないと結論。(間違っている確率は5%以下)だと言ってます。

エクセルでの計算ですが、まず関数CORRELを使ってr値を出します。xデータがA1からA10に、yデータがB1からB10に入っているとして

r=CORREL(A1:A10,B1:B10)

次にそのr値をt値に変換します。

t=r*(n-2)^0.5/(1-r^2)^0.5

ここでnは組みデータの数です。((x1,y1),(x2,y2),・・・(xn,yn))
最後に関数TDISTで確率に変換します。両側です。

p=TDIST(t値,n-2,2)

もっと簡単な方法があるかも知れませんが、私ならこう計算します。(アドインの分析ツールを使う以外は)

pは確率(probability)のpです。全く相関のない数字を組み合わせたときにそのr値が出る確率をあらわしています。

統計・確率には100%言い切れることはまずありません。というか100%言い切れるのなら統計・確率を使う必要は有りません。
例えばサイコロを5回振って全て同じ目が出る確率は0.08%です。そんな時、そのサイコロを不良品(イカサマ?)と結論つけるとわずかに間違っている可能性が残っています。ただ、それが5%以下ならp=0.05でそのサイコロは正常ではないと結論付けます。
それが危険率です。(この場...続きを読む

Q293細胞の培養方法について

先々週に293細胞を起こしましたが(ストックは1年半ほど前のもの)、なかなか増えてくれません。ほとんんどの細胞が浮いていて、接着している細胞も塊のようになっている状態です。どなたか293細胞を使用したことがある方、培養のコツのようなものがありましたら教えてください。よろしくお願いします。
培地はDMEM(high glucose)、継代の時はPBS-EDTAを使用し、37℃,5% CO2のインキュベーターで培養しています。

Aベストアンサー

培地を死んでいると思われる浮遊細胞と一緒に除きます。

そのあと、塊のようになっている状態をピペッティングやトリプシンでやさしくばらばらにします(増殖を早めるため)。その細胞はそんな感じになるので心配要りません(あまり少ないとまずいが)。

あまり細胞濃度がうすくならないように数に応じて、小さいプレートやウエルにまきなおします(~30%密度くらい)。細胞が一部伸展していることを確認し、時間が許すならひたすら待ちます。

Q細胞のコンタミの原因について質問です。

現在、接着細胞の培養を行っているのですが、誤って培養液に対する細胞溶液の量をいつもよりも4倍入れて継代をしてしまいました。一日目は大丈夫だったのですが、二日目にコンタミをおこしていました。
これはやはり、細胞が増えすぎたからでしょうか。お答えいただけると助かります。

Aベストアンサー

 No.2のJagar39です。

 フラスコで培養していたんですね。とすると、No.4さんが指摘されたインキュベーター内でのコンタミの可能性は消して良いでしょう。シャーレやプレートで培養する時はたまにあることですが・・・

 「たまたま」のコンタミであれば今後それほど心配することはないと思いますが、メディウムやトリプシンなどがコンタミしていないかは一度確認した方が良いと思います。

 過増殖で細胞が死んだりした時、メディウム中に細胞が高濃度に浮遊するため、「コンタミ」と間違える時があります。
 また、メディウムは普通冷蔵庫でストックしていると思いますが、冷蔵状態だと作製時にコンタミしていても増えてくるのにたいへん時間がかかるため、すぐには原因がわからないことがあります。
 なので私は、だいたい一度に3Lのメディウムを作っていたのですが、200mlほど小フラスコに入れてインキュベーターの中に入れっぱなしにしていました。そうしておくと、コンタミしていた時には比較的早期に判るので。

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Q腫瘍細胞にタンパク質を過剰発現するやり方

初めて質問します。
21歳の医学部生です。
いま実験を行っていて、B16メラノーマという細胞にIRAK-1とIRAK-4というふたつのタンパク質を過剰発現させたいのです。
ネットで探したところ、目的のタンパク質のDNAの相補的DNAをベクターに組み込んでそれを腫瘍細胞に形質導入するという方法を見つけたのですが、それで、過剰発現させることができるのでしょうか。
また、たった区別の方法があるのでしょうか。

基本的な質問ですみません。回答をよろしくお願いします。

Aベストアンサー

『目的のタンパク質のDNAの相補的DNAをベクターに組み込んでそれを腫瘍細胞に形質導入するという方法を見つけたのですが、それで、過剰発現させることができるのでしょうか。』
pcDNA3.1 (Invitrogen)などの薬剤耐性遺伝子を含む発現ベクターに目的の遺伝子を組み込んでLipofectamin (Invitrogen)やFuGENE (Roche)などの試薬を使って細胞に導入する方方が一般的です(した)が、今はレンチウイルスにパッキングして細胞に導入する方が効率が良いのでそちらを好む人が増えています。

二種類の遺伝子を導入する場合は、一度にやれないこともないけれど、まず、片方を導入してポジティブな細胞を拾い、それにもう一つの遺伝子を導入するのがよいのではないでしょうか。

遺伝子を細胞に導入した後は培地にピューロマイシンなどの薬剤を入れて目的の遺伝子の入っていない細胞を殺し、残った細胞のコロニーをピックアップして一部をPCRやウエスタンブロッティングで目的の遺伝子が入っているかどうか確認できます。


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