RAW264.7細胞へのトランスフェクション
分子生物学的実験初心者です。よろしくお願いします。
RAW264.7細胞を用いたルシフェラーゼアッセイを行うために、プラスミドのトランスフェクションを試みています。
Lipofectionの試薬としてはFuGENEHDを用いています。
RocheやPromegaのサイトの推奨条件の通りにRAW264.7細胞にトランスフェクションを行っていますが、メーカーの出している数値のようなトランスフェクション効率が得られません。
メーカーでは40-50%のトランスフェクションが得られるとしていますが、自分の実験では5-10%程度です。
実験時に参考にしたPromegaのサイト
http://www.promega.com/techserv/tools/FuGeneHD/d …
RAW264.7細胞を用いてトランスフェクション実験をされている方で、トランスフェクション効率を上げるための何かコツのようなものがありましたら、教えていただけないでしょうか。
FuGENE、また他の試薬(Lipofectaminなど)でのトランスフェクションのいい方法がありましたら、教えて下さい。よろしくお願いします。
A 回答 (3件)
- 最新から表示
- 回答順に表示
No.3
- 回答日時:
ということは、
最初の補足で言っている実験では、
EGFPでは70-80%のトランスフェクション効率だった。
二番目の補足で言っている実験では、
EGFPでは5-10%のトランスフェクション効率だった。
ということでしょうか???
要するに、トランスフェクションが安定しない、ということでしょうか??
もしそうならば、細胞の状態に気を配って下さい。
トランスフェクション後、死んだ細胞が多かったりしませんか?
細胞の維持というのは難しいものです。
この回答への補足
舌足らずな説明で申し訳ないです。
2つの細胞を用いて実験を行いました。
まず293T細胞を用いて実験を行い、その後RAWcellを用いて実験を行いました。
最初の293T細胞を用いた実験では、ルシフェラーゼアッセイはうまくworkしました。EGFP発現ベクターによるトランスフェクション効率も70-80%と良好でした。
その後、RAWcellに対して同じプラスミドを用いてルシフェラーゼアッセイを試みているのですが、そのRAWcellを用いた実験がうまくいっていません。
うまくいかない主な理由として、RAWcellの実験で十分なトランスフェクション効率が得られていない、ということが考えられ、トランスフェクション効率を上げる方法に関して、ここに質問した次第です。
No.2
- 回答日時:
>transfection効率は、EGFP発現ベクターを用いて蛍光顕微鏡下で確認しました。
そうでなくて、
>自分の実験では5-10%程度です。
「自分の実験」とはルシフェラーゼアッセイを行なうためのトランスフェクションではないのでしょうか?
その効率が5-10%程度とおっしゃっているのではないですか?
そのルシフェラーゼアッセイのために行なったトランスフェクションが5-10%程度と、どのようにして確認したのか?
ということです。
この回答への補足
誤解を招く表現でした。
ルシフェラーゼ活性評価のための「自分の実験」では、トランスフェクション効率を直接評価はしていません。
目的のルシフェラーゼ活性、pRL-TKの活性ともバックグラウンドと全く変わらないため、トランスフェクションはほとんど出来ていないもの、と判断しました。
トランスフェクション効率を評価するため、「自分の実験」に用いたプラスミドとは別に、EGFP発現ベクターを用いてトランスフェクションを行い、その際に確認したトランスフェクション効率が5-10%でした。
※「自分の実験」で用いるルシフェラーゼベクター、pRL-TKとも293T細胞ではうまくトランスフェクションされて、workすることは確認しています。(その際の、そのベクター自体のトランスフェクション効率は確認していませんが、、、)
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
似たような質問が見つかりました
- がん・心臓病・脳卒中 ハスミワクチンによるがん治療について 11 2022/08/07 13:41
- 英語 Various natural and synthetic barrier membranes ha 3 2022/11/30 17:08
- 医学 発がん性物質のエビデンスなのですが、①と②の違いを教えて下さい。 ①雌雄のラットに本物質を2年間混餌 1 2022/04/04 21:35
- 生物学 疑問に思ったことがあるんですけど。 人間の細胞と、他の生物の細胞を持つ事って可能ですか?性行ではなく 2 2022/10/16 12:33
- 生物学 細胞死について 細胞内の組織の分解が、その同じ組織の構築と修復と同様に能動的な生体現象であるのなら、 1 2023/04/01 20:03
- 医学 【オーバードーズ】新型コロナに感染して薬のカロナールを服用時にオーバードーズには気を付 1 2023/01/01 01:21
- その他(健康・美容・ファッション) 炎症性のニキビ、アトピー性皮膚炎などでからだリケアサプリ(幹細胞培養サプリ)を試してみようと思ってい 3 2022/08/14 12:19
- 宇宙科学・天文学・天気 未だに無から有が生じたと言うビッグバンや偶然自然に無機質から有機質・生物・単細胞が発生し 4 2023/04/16 09:39
- 生物学 細胞と細胞の間には何があるんですか? 4 2022/08/12 00:18
- 生物学 理科についての些細な疑問です。 遺伝の規則性というメンデルさんのエンドウの実験があったと思います。丸 3 2022/08/27 16:53
おすすめ情報
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
-
マイクロブラックホール
-
状態ベクトルはなぜ線形空間の...
-
「被験者」と「被検者」の使い...
-
ろ紙に裏表はあるのですか?
-
学生実験で行う中和滴定のレポ...
-
欠席したらやばいことを知らず...
-
ファクターについて
-
ユニバース25は本当にあった実...
-
●● 服についた硫黄臭をなくし...
-
ヤング率の実験について
-
無色透明な油・オイルで手頃な...
-
薬学部の実習
-
デーモンコアってどうして安全...
-
数学科は楽という噂は本当ですか?
-
ガスバーナーの下に・・・
-
液体窒素って幾らで買えますか?
-
RC直列回路の実験で理論値と測...
-
薬学部の実習
-
単相電力について実験したので...
-
TLCによるカフェインの分離につ...
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
-
「被験者」と「被検者」の使い...
-
ろ紙に裏表はあるのですか?
-
欠席したらやばいことを知らず...
-
ユニバース25は本当にあった実...
-
ガスバーナーの下に・・・
-
数学科は楽という噂は本当ですか?
-
紙が7回以上折れないワケ
-
無色透明な油・オイルで手頃な...
-
科学の実験手順・操作のフロー...
-
学生実験で行う中和滴定のレポ...
-
デーモンコアってどうして安全...
-
ファクターについて
-
質問者の方が博識で経験もある...
-
地下核実験による地震で最大の...
-
薬学部の実習
-
P1 P2実験室の申請について
-
プランク定数の実験で‥
-
大学の留年理由、これってあり?
-
●● 服についた硫黄臭をなくし...
-
RC直列回路の実験で理論値と測...
おすすめ情報