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タイトルどおりなのですが、35Sプロモーターの35Sとはどういうことですか?また、プロモーターの場合35S以外もあるのでしょうか。あれば、機能の違いなどについても教えてくださいm(__)m

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A 回答 (2件)

SはS値(スウェードベリ値)のことです。


35Sについては、参考URLをお読みになって下さい。

また、CaMVの詳細については、
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/150100 …
http://www.mpl.ird.fr/genetrop-old/caulimovirida …
が参考になるかと思います。


35Sと言うことなら、植物に限っての話でよろしいでしょうか?
35Sプロモーターは植物のさまざまな器官・組織で発現する(器官特異性がない)特徴があります。
プロモーターには、器官・組織に特異的に発現するもの、ストレスを与えて誘導されるもの等、
さまざまな種類があります。
挙げたら切りがないので、google等の検索エンジンで「プロモーター 植物 発現」のように
キーワードを工夫してご自分で検索して下さい。

参考URL:http://www.i-sis.org.uk/camvrecdis.php
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以下の参考URLは参考になりますでしょうか?


「26S」
http://biotech.nikkeibp.co.jp/netlink/bckk/repor …
(超遠心分析法)
http://www.jarmam.gr.jp/situmon/16ribo_2.html
(バクテリアの“16sリボゾームRNA”って, なに???)

ご参考まで。

参考URL:http://mukb.medic.kumamoto-u.ac.jp/AAA/keyword.h …
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QCaMV35Sプロモーターについて

CaMV35Sプロモーターは、植物以外、例えば動物細胞内等では全く活性を持たないのでしょうか?

ヒーラ細胞でウミシイタケルシフェラーゼの一過性発現を調べたいと考えています。

で、手元に植物用に使っていた35Sプロモーター制御下のウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドがあるのですが、これを流用できないものかと思いまして…。

Aベストアンサー

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T3C-491C38S-1&_user=149009&_coverDate=08%2F15%2F2003&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000012358&_version=1&_urlVersion=0&_userid=149009&md5=7a00f59606bb153fc1747b255e05d0cb

まったく活性をもたない、というわけではないようですが、上記の論文の要旨を見るとCMVプロモーターの0.01%程度の活性しかないようです。
ですので、そのままLucアッセイを実施するのはちょっと難しそうです・・・。

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

Qpoly-Aとは

poly-Aとはなんでしょうか?
あとpoly-A付加シグナルについても教えてください。

Aベストアンサー

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
この一時転写産物はイントロンを削除しエクソンを連結するスプライシング、5'末端に一個の7-メチルグアノシン(7-m G)を付加(cap構造といいます)するcapping、3'末端にpoly-A tailを付加するpolyadenylationを経て成熟mRNAになります。

poly adenylationは、最終エクソン内のAAUAAAという配列(polyadenylation signal ポリアデニル化シグナル, poly-A additional signal ポリA付加シグナル)を認識するpoly-A polymerase ポリAポリメラーゼによって行われます。この酵素はポリアデニル化シグナルの10~30塩基下流で一時転写産物を切断するとともに、鋳型に依存せずにアデニンを付加します。なお、ポリアデニル化シグナルには例外も知られています。

参考URL:http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW2/MG234.html

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
この一時転写産物はイントロンを削除しエクソンを連...続きを読む

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

Qグリセロールストックについて?

学生時代、大腸菌をグリセロールストックすると保存状態が良く長期間保存できる?という事をを教わったような記憶があります。なぜ普通に凍結するより状態が良いのでしょうか?理由とグリセロールストックの操作方法を教えて下さい。又、大腸菌以外の微生物にも有効なのでしょうか?教えて下さい。お願いします

Aベストアンサー

細菌類ならなんでもできると思います。
細菌を培養した液を保存用の小さいチューブに移し、グリセロールを加えて冷凍し(液体窒素やドライアイスなどで急速冷凍するのが望ましい)、マイナス80℃のフリーザーで保存します。半永久的に保存できます。グリセロール濃度はものの本や各メーカーから提供される形によって15-50%と幅がありますが、濃度が低めのほうが再融解しにくく持ちが良いように感じます。
使用するときは、凍結したまま少量を削り取って培地にまきます。

ちなみに、生物学研究で用いられるモデル生物のひとつ、線虫もグリセロールストックします。

Qプロモーター領域

ある既知のタンパク質遺伝子のプロモーター領域の配列を知りたいというときにはどのように検索すればよろしいのでしょうか。
タンパク質そのものの配列までは調べられたのですが…その後がよくわからなくて。

Aベストアンサー

実験的に同定するのは結構手間です。
まず、転写開始点を正確に決めておく必要があります。
簡便には、5' RACEの産物の端がどこにきてるかで見てもいいと思いますが、完全に伸びきっていない逆転写産物もPCRで増やしてしまうので、多少のあいまいさがでてきます。
正確に決めるには昔ながらのprimer extensionやS1 mappingが必要でしょう。
で、プロモーターは(発現をmodulateするエンハンサーは話が別です)、典型的には転写開始点の-50 bp以内にあります。たとえば、真核生物では、-20 bp 前後にTATA boxまたはGC box、さらに-15 bp くらい上流に-CAATboxとか。そういう典型的な配列があれば、8割がたそこがプロモーターだという蓋然性を言うことができます(かならずしも典型的なプロモーターばかりではありませんが)。
ちゃんと実験的に証明しようとしたら、候補となる領域にレポーター遺伝子をつないで、in vitroやin vivoで転写活性を調べなければならないでしょう。システマティックに欠失シリーズや、点突然変異を作って、どの配列がプロモーター活性に必要十分であるかを明らかにすれば完璧です。

実験的に同定するのは結構手間です。
まず、転写開始点を正確に決めておく必要があります。
簡便には、5' RACEの産物の端がどこにきてるかで見てもいいと思いますが、完全に伸びきっていない逆転写産物もPCRで増やしてしまうので、多少のあいまいさがでてきます。
正確に決めるには昔ながらのprimer extensionやS1 mappingが必要でしょう。
で、プロモーターは(発現をmodulateするエンハンサーは話が別です)、典型的には転写開始点の-50 bp以内にあります。たとえば、真核生物では、-20 bp 前後にTATA boxま...続きを読む

Q突然変異処理

酵母を用いた実験を行いました。
野生株に変異処理をし、いろいろな変異株を分離するという内容でした。
変異処理の際、今回はEMS(エチルメタンスルフォネート)を使用しました。
ここで質問なのですが、EMSはどのようなメカニズムで変異誘発するのでしょうか?EMSはアルキル化剤で、DNA塩基の化学修飾をするようなのですが、具体的にどのようなものなのかを知りたいです。
どなたかご存知の方は教えて下さい。よろしくお願いします。

Aベストアンサー

他にもあるのでしょうが
教科書的にはグアニンにエチル基をつけてエチルグアニジンにすることにより
グアニン―シトシンがアデニン-チミンにトランジションするといわれています。

http://mmg.uth.tmc.edu/webpages/faculty/supplements/dgarsin/DNAstructuredamage.ppt
の30p前後をごらんください。

参考URL:http://mmg.uth.tmc.edu/webpages/faculty/supplements/dgarsin/DNAstructuredamage.ppt

Q2つのシークエンスによる結果の違い

PCR後の精製産物をシークエンスするダイレクトシークエンスとクローニングしてプラスミド回収してからのシークエンスの2パターンで配列解析をしました。

するとダイレクトシークエンスはうまく読めたのですが、もう一方のシークエンスのほうは、配列を読めずNと表示されました。

一般的にダイレクトシークエンスは、うまく配列を読むことが困難だということを聞いたことがあります。

今回このような結果になったのは、たまたまなのでしょうか?

またダイレクトシークエンスの長所は、クローニングをしないので短期間でシークエンスが可能。短所は読めない配列が多いと聞いたことがあります。
そこでクローニング済みのシークエンスのほうの長短所って何なのでしょうか?

回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

こんにちは。

実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa(配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね)が5個なので、鋳型はA型が3に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、1:1ではなく、2:1とか4:1の定量性を見るのは難しいかと思います。

ダイレクトシーケンスは、増えたPCR産物をそのまま読むために、鋳型のある塩基が----taatGc----と----taatCc----が1:1で含まれているとき(ヒトゲノムでは父方と母方の塩基が違うことがよくあります)、次のようなメリットが考えられます。
・(メリット)そのシーケンスの波形はGとCが一対一で出てくるように定量性がややあること
・(メリット)シーケンシング反応はたまにエラーを起こしますが、それはマイノリティになります。正しい配列の波形の方が大きく出るので、鋳型の配列にほぼ一致した配列が読めます。

クローニング済みのシーケンスは、1クローンだけ読むと、その配列がシーケンシング反応によるエラーの塩基置換を含む危険性が高い一方で、
・一見、単一の産物に見えても1塩基レベル、あるいは全体にわたって複数の産物がPCRで増幅されたときに、複数のクローンをシーケンスすることでなにが増えたか調べられます。ダイレクトシーケンスではこれは難しいです。
・(先の方も書かれていますが)基本的には単一のプラスミドの配列を読むため、シーケンスがきれいに読めるはずですし、その後の応用(発現用のベクターに入れる)にはプラスミドでの塩基配列の正しさの確認が必要です。

クローニングしたプラスミドを読む場合はインサートの長さにもよりますが、最低3個くらい読んだ方が良いと思います。

プラスミドのシーケンスがうまくいかなかったとのことですが、制限酵素で確認されたのことでものは入っているのだと思います。シーケンシング反応はエタ沈がちょっとマズイだけでシーケンスが読めなくなったりするので、もう一回同じ事をやると読めるようになるかもしれません。
シーケンシングプライマーですが、プラスミドにあるシーケンシングプライマーの配列(T7, SP6, M13など)が実は、シーケンシング反応に有利な配列でないことがあります。最近は合成オリゴの値段も安いので、「同じ配列を複数読む」ようなことであれば、自分の入れたインサートにある配列でシーケンスされるのがよいと思います。「中から外に読む」感じです。もし、サイズが500bpとか小さいようならPCRで増やしたときに使ったfowardとreverseプライマーで網羅できるでしょう。
あと、ご存じと思いますが、シーケンス反応に持ち込むプラスミドとPCR産物の至適な量が違うので、そこの確認をされても良いかと。

また、制限酵素処理の代わりに、拾われたプラスミドを一度50uLのLBに移して、そのうちの1uLを鋳型にコロニーPCRなどでインサートの有無を確認して、インサートの入ったものだけを増やすとたくさんのコロニーをカルチャーしなくて済みます。

がんばってくださいね!

こんにちは。

実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa(配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね)が5個なので、鋳型はA型が3に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、1:1ではなく、2:1とか4:1の定量性を見...続きを読む

Qnull mutantって?

null mutantとは、どういう変異体のことですか?
遺伝子自体がない変異体ですか?それとも、あるけれども、挿入など、遺伝子中になにがしかの変異が生じて、機能しなくなった遺伝子を持っている変異体のことですか?
どういう変異体をnull mutantというのかわかりません。
教えてください。

それとも、その遺伝子がふつうは生物中にいくつもあるはずなのに、ひとつもないこと・・・・?

Aベストアンサー

下記URLは参考になりますでしょうか…

遺伝学概論
http://www.fides.dti.ne.jp/~fuyamak/genetics/index.html
第4章  眞核生物の遺伝子とその発現
http://www.fides.dti.ne.jp/~fuyamak/genetics/chap4.html
4-2 対立遺伝子間の相互作用
アモルフ(amorph): 
 突然変異遺伝子が形質発現効果を示さない。機能喪失突然変異(loss-of-function mutationまたはnull mutation) ともいう。酵素タンパクをコードする遺伝子の場合、野生型対立遺伝子に対して劣性であることが多い。しかし、遺伝子産物を大量に必要とする遺伝子の場合は優性になることもある。

(例)ショウジョウバエのMinute突然変異
 ショウジョウバエでは、Minuteと総称される数10種類の優性突然変異が知られている。いずれもヘテロ接合個体の剛毛が短くなり、発育が遅延するといった表現を示す。ホモ接合は生存不能なので、Minute突然変異は同時に劣性致死でもある。Minute突然変異はMinute 遺伝子の欠失が原因であることがわかっている。遺伝子そのものが欠けているので、当然のことながらアモルフである。実は、これらの遺伝子座はいずれもリボソームタンパクをコードしていることがわかっている。リボソームタンパクはどの細胞でも大量に必要とされることから、遺伝子が半量ではタンパク量が不足するため、剛毛の形成や発育速度に影響するのである。

参考URL:http://www.fides.dti.ne.jp/~fuyamak/genetics/chap4.html

下記URLは参考になりますでしょうか…

遺伝学概論
http://www.fides.dti.ne.jp/~fuyamak/genetics/index.html
第4章  眞核生物の遺伝子とその発現
http://www.fides.dti.ne.jp/~fuyamak/genetics/chap4.html
4-2 対立遺伝子間の相互作用
アモルフ(amorph): 
 突然変異遺伝子が形質発現効果を示さない。機能喪失突然変異(loss-of-function mutationまたはnull mutation) ともいう。酵素タンパクをコードする遺伝子の場合、野生型対立遺伝子に対して劣性であることが多い。しかし、遺伝子産物を...続きを読む


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