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フェノール硫酸法で糖の定量を行っています。

検量線作成のためグルコースを蒸留水に溶かし吸光度を測定しているのですが、全く同じ溶液(反応は別々にさせてます)を測定しても吸光度にかなりの差が出てきてしまいます。
 私自身の今までの経験では、硫酸を添加する仕方により反応の温度が異なり、その結果吸光度に差が生じるのではないかと思うのですが、もしそうならばどのような対処方法があるのでしょうか?

 何かご存知の方がいればよろしくお願いします。

A 回答 (3件)

 硫酸の添加方法ですが、私は必要な量を一気に勢いよく液面へ当てるように添加しました。

硫酸と試料をすばやく反応させるためにはこのようにしたほうがよいと思います。

 一滴ずつ添加すると、反応のしかたにばらつきが出ると思います。

 この反応は硫酸の添加方法が精度に大きく影響を及ぼすので、添加に要する時間も一定にするようにしてください。
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この回答へのお礼

ありがとうございました。試してみます。

お礼日時:2004/09/30 18:26

 私は各操作の時間、特に硫酸の添加後の放置時間を1秒単位で合わせ、添加方法もできるだけ同じ動作をすることを心がけてました。


 またブランクの値もたまに異なることがあるので、毎回きちんと差し引くことも大事です。
 さらに測定範囲が200μg/mlぐらいなので、それ以上の濃度でやると上記の方法で行っても、ばらつくので気をつけてください。
参考になるか分かりませんが、私の体験談でした。
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この回答へのお礼

お返事ありがとうございました。
その後の実験では、比較的同じような吸光度がそろうようになりました。

最後にもう一つ質問ですが、硫酸の添加方法についてですが、どのように添加するのが一番よいのでしょうか?私としては、サンプルの液面に直接落ちるように、はじめはゆっくりとホールピペットで一滴一滴添加しているのですが・・・。一度に添加すると、激しく沸騰して吸光度がそろわないようになるような気がしたのですが。

たびたび申し訳ないですが、何かご存知なら教えてください。よろしくお願いします。

お礼日時:2004/09/30 10:08

フェノール硫酸法による糖の定量では、経時的に吸光度が変化しますから、各サンプルの反応時間をきちんと合わせる必要があります。



例えば、最終試薬(フェノールが後でしたっけ)の添加を1分ごとに行い、直ちに攪拌して、反応時間15分とすれば、15サンプルまで測定できますね。
1本目が15分経った時から吸光度を測り始め、1分ごとに測定していきます。

きちんとできれば、r2=0.999くらいは出せますよ。

それでも、試験が変わればその時々の条件で、同じ濃度の吸光度もばらつきますから、検量線は毎回作成してください。

この回答への補足

すみません。もう一つお聞きしたいことがありました。

同じ濃度でも吸光度にばらつきがでると言うことですが、私のやったところでは、同じ濃度の試料を3つ測って、うまくいけば吸光度で0.005も変わらないこともあるのですが、大きいときには差が0.02くらいにまでなってしまいます(試料は30ppmくらいです)。
このくらいの差は仕方がないのでしょうか?もしどうしても差が出るようならば、試料を3回測って平均値を使うほうが良いのかなとも思うのですが。

補足日時:2004/09/30 22:27
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この回答へのお礼

回答ありがとうございました。

ちなみに私は試薬添加後の反応時間は40分おいています。本などには30分と書いていましたが、40分以降で吸光度が安定したので、毎回きっちり40分静置してます。ま、やり方は人によって違うんでしょうけど・・・。

お礼日時:2004/09/30 20:40

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