ＭＴＴアッセイ時のコツについて教えてください。

現在、阻害剤を使った細胞の増殖活性実験をＭＴＴアッセイを用いて行っています。

その際にウェルの付着した細胞のみを対象としたいために（浮遊細胞はいらないです）、ＭＴＴを入れてインキュベートした後に、９６ウェルをひっくり返して上澄みを捨てる方法と、ピペットで１ウェルずつ上澄みを吸い上げて捨てる方法を取っているのですが、どうも値のズレが大きく信用性がありません。このようなＭＴＴアッセイにはコツなどがあるのでしょうか？

それと一般的な阻害実験の場合には、１ウェルに入れる細胞数などというのはだいたい決まっているのでしょうか？

ＭＴＴアッセイを初めて行うような初心者ですので、初歩的な質問かと思いますがご教授よろしくお願いいたします。

No.1 回答者： pi3-kinase 回答日時： 2006/08/23 17:55

補足していただきたいのですが・・・。

詳しいプロトコールをお教えください
(1)阻害剤を添加する時の細胞数(??% confluent)
(2)阻害剤を添加してから、MTTアッセイをするまでの時間
(3)MTT反応時間
それから、上清を取るという操作はどの段階でしているのでしょうか？
ちょっと、文面からはどこの操作か察しかねましたので、お願いします。

この回答への補足

ありがとうございます。

（１）細胞数は1×10^6(10の6乗)コ/mlに調整した物を1ウェルに80μlずつ入れてますので、約25,000コになります。
（２）阻害剤を添加して２日後にMTTアッセイを行っております。
（３）MTTを添加して２時間後に酸性イソプロパノールを入れて測定しています。

通常、MTTアッセイは、MTTの反応後に上澄みを捨てて、Formazanを酸性イソプロパノールで溶解して吸光度測定をすると思います。
そこで、沈着細胞のFormazanのみを測定するために、ただ単に上澄みを96ウェルをひっくり返して捨てただけでは浮遊細胞のFormazanを取り除くことはできないと考え、ピペットで上澄みを吸い取り、ウェル内をPBSで洗浄して、それから酸性イソプロパノールを加えて吸光度測定をするという手順を踏んでいます。

わかりにくい文章かもしれませんが、よろしくお願いいたします。

補足日時：2006/08/23 21:55

No.2 ベストアンサー 回答者： Chicago243 回答日時： 2006/08/24 00:23

細胞の数は実験よってことなりますが、接着細胞でよく増える細胞なら3000/wellゆっくり増えるもので10000/wellぐらいでしょうか。

接着細胞の場合は浮いている細胞は大抵死んで(調子が悪くなって)浮いてくるので、バイチに直接MTTをほりこんで、反応後は溶液(バイチ)を捨てずにSDSなどでをくわえてフォルマザンをようかいするという手があります。ちょっとフォルマザンは溶かすには手強いですが、可溶化の方法はほかにもあるかもしれません。

コントロールでもばらつきますか?それによっても判断が変わるかもしれません。薬剤処理の細胞ははがれやすくなってるかもしれませんね。MTTは細胞の数をミトコンドリアの酵素の活性を測定して見積もるものです、薬剤が酵素活性に直接または間接的に作用すると何か予期せぬことがおこる可能性があります。
方法を改良したにもかかわらずうまく行かない場合は違うあっせいをためしてみるのもてかもしれません。ほかにこのようなキットがあるます。細胞が壊れて出てきた酵素を測る方法です。

http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php?pGMPID=141 …

参考URL：http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php?pGMPID=141 …

この回答へのお礼

ご教授ありがとうございました。
やはり始めの細胞数が多すぎるのも原因かもしれませんね。早速、少なくしてやり直してみます。
また、培養液を捨てずにＳＤＳで可溶化する方法も試してみます。

簡単に、培養液を捨てずに即酸性イソプロパノールを入れるというやり方はいけないものなのでしょうか？という、素朴な疑問を持っています。

また、細胞をしっかり均一にいれていないのかもしれないと、コントロールばかりやってみたのですが、この場合は吸光度のばらつきが0.01～0.05辺りで揃っていました。

他のアッセイのご教授もありがとうございました。

お礼日時：2006/08/25 12:22

No.3 回答者： fujishiro 回答日時： 2006/08/24 02:00

ＭＴＴアッセイそのものよりは９６穴プレートだからやりにくいのでしょうね。

また、細胞によるでしょうが二万五千というのは多いでしょう。

私は癌細胞で五千か一万、４８時間後にスタートしてあなたと同じことやってましたが。
ただ、８点取って、一番多いのと低いのは省いて６点の平均をとるとかしてましたね。お金が問題なら５点とって中央３点の平均をとるとか…。

マイクロピペットで細胞を蒔くと、それなりにうまくやらないと９６穴には均等に蒔けません。
まぁ、道具の問題もあるでしょうが、マルチピペットとかないですか？コントロールにぶれがありませんか？
また、ＰＢＳで洗わない場合のぶれはみたことありますか？

この回答への補足

ご教授ありがとうございました。
やはり始めの細胞数が多すぎるのも原因かもしれませんね。早速、少なくしてやり直してみます。
また、細胞をしっかり均一にいれていないのかもしれないと、コントロールばかりやってみたのですが、この場合は吸光度のばらつきが0.01～0.05辺りで揃っていました。
この時にPBSで洗う時と洗わない時でみたのですが、PBSで洗うと全体的に吸光度が0.2程均一で下がります。

やはりマルチピペットが欲しいですね。これがないのです・・・
うちの研究室で初の細胞系実験ということで（普段はタンパク質関連です）、まだマルチピペットがないのです。

補足日時：2006/08/25 12:27

この回答へのお礼

とにかくテクニックを上げて、当分は多目に取って平均を出すことにしました。
この度は丁寧なご回答ありがとうございました。

お礼日時：2006/09/03 20:01