痔になりやすい生活習慣とは?

DNA断片をPCRで増幅し、電気泳動で検出する実験なのですが、「泳動バンドとして目に見えるほどまでは増えなかったサンプルでは、PCR反応中に何が起こっているか」という問いで、考えてもわかりません。どなたか教えてください。よろしくお願いします。

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A 回答 (2件)

解釈しにくいのですが、増幅しなかった原因も含めるかと思いました。


おそらくサンプルでは
(解離温度、伸長温度、アニール温度が適切でないため)、
DNA断片が一本鎖(二本鎖)にならなかった、酵素が働かなかった。

(伸長時間が短くて(DNA断片が長すぎて)、)酵素が最後まで増幅できかった。

などが考えられると思います。原因はまだありますが、
このようなところだと思います。
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問題の丸投げは‥



問題文の内容からすると、
「検出限界以下の増幅」は起きていることが前提で、
反応中に起こっていることなので、組成の問題ではありませんね。

実験と書いているので他にどのような前提条件があるのかわからないのですが、
例えば、
○機械が途中で止まった
○誰かが蓋を開けてしまい、水が蒸発して溶液の濃度が変わった
○高次構造をとってしまい、増幅が阻害された
○耐熱性ではないポリメラーゼが入っていて、失活した
○誰かがチューブにEDTAなどをいれて反応が阻害した
○テンプレートの量かサイクル数が少なくて十分に増幅しなかった
○テンプレートなどといっしょに持ち込んだプロテアーゼがポリメラーゼを分解した

などは、「泳動バンドとして目に見えるほどまでは増えなかったサンプルでは、PCR反応中に何が起こっているか」
の回答になり得ると思います。
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Q学生実験のPCRについて教えてください・・

私は化学系の学科に所属する大学生です。

生物化学の学生実験でPCRとゲル電気泳動を行ったんですが、課題の回答がわからず困ってます・・・
どなたか教えていただけませんか?

(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか?

(2)全くバンドが検出されないサンプルもあるが、それはなぜか?

(3)mRNAの発現を正確に行うのになぜPCRのサイクル数が重要なのか?

(4)電気泳動で検出されたバンドに関して、bpを解析する際にサイズマーカーの位置と比較する以外にどう考察・解析したらいいのか?

4つもあってすみません!生物系はほんとに苦手なんです・・
どれか1つでもいいので教えてください!
あとできれば考察の材料なんかも教えてもらえると嬉しいです・・

Aベストアンサー

(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか?

PCRの原理を見ると理論上2のn乗(n=サイクル数)で
PCR産物は増えていきます。
そのため25と30サイクルだと2の5乗の違いが出ます
ただ、実際やってみるとわかるのですが
鋳型量が多かったりするといち早く
PCRが限界量まで増えてしまうことがあります
それはPCRが進むことでdNTPやプライマーが
失われたり、酵素が失活するためです。
25サイクルよりも前にプラトーに達するようですと
25と30の間に差は大してなくなります。

(2)全くバンドが検出されないサンプルもあるが、それはなぜか?

一言で言うとPCRがうまくいっていない
ということですね。
プライマー設計が悪い。鋳型の状態が悪い
作業的なミス(入れ忘れなど)
Tm値などのプログラムミス
こういったところでしょうか

目的のものがあるか無いかという実験であれば無い

(3)mRNAの発現を正確に行うのになぜPCRのサイクル数が重要なのか?

mRNAの発現量を観察する場合は
ほとんどの場合、いったんcDNAに逆転写して
その後、そのRT-PCR産物を鋳型として
通常のPCRを行います。

肝心の目的物の量を測る方法はいくつかあるのですが
最も簡単なものはPCRがプラトーに達する前に
PCRを止め(20サイクル程度)電気泳動後
ゲル染色やサザンブロットによって
目的産物量を可視化、定量します。
mRNA量が多い=鋳型量が多い=同サイクル数なら
より強いシグナル
となるわけです。

もう一つの方法はリアルタイムPCRと呼ばれる方法で
検出試薬にサイバーグリーン(2本鎖のみが
検出される)を用いて1サイクル進むごとに
PCR産物量をシグナルから算出する方法です。
「ライトサイクラー」で検索すると
その機器がどういうものかわかると思います。
これを使って
「ある一定量にPCR産物が達するときのサイクル数」
を求めます。mRNA量が多い=鋳型が多い=より少ない
サイクル数で一定量に達する


(4)電気泳動で検出されたバンドに関して、bpを解析する際にサイズマーカーの位置と比較する以外にどう考察・解析したらいいのか?

目的のバンド以外があるのか無いかも重要です。
PCRの特異性は実験によっては非常に重要に
なるからです。

低分子側にもわっとしたシグナルが多いと
プライマー設計やPCR条件がゆるく、
プライマーダイマーができているとか
いうことも電気泳動像から見ることができますね

(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか?

PCRの原理を見ると理論上2のn乗(n=サイクル数)で
PCR産物は増えていきます。
そのため25と30サイクルだと2の5乗の違いが出ます
ただ、実際やってみるとわかるのですが
鋳型量が多かったりするといち早く
PCRが限界量まで増えてしまうことがあります
それはPCRが進むことでdNTPやプライマーが
失われたり、酵素が失活するためです。
25サイクルよりも前にプラトーに達するようですと
25と...続きを読む

Q電気泳動でバンドが出ない理由(学生実験)

Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。

大腸菌のコロニーに
TE/RNaseA

NaOH(アルカリ変性させた)

NaOAc(中性に戻した 大腸菌のゲノム:ニックが入ってもとに戻らない、プラスミド:元に戻る)

phenol/chlorophorm(ph層:大腸菌のゲノム  水層:プラスミドをふくむ)

水層をとりだしてisopropannol加える

ethanol(洗浄)
の順で操作を行った後、電気泳動しました。

しかし、私がやったサンプルはバンドがだいぶ薄くなってしいました。
その理由がわからず悩んでおります。

予想としては、phenol/chlorophormをいれて遠心をかけて油層と水層にわけたときに、二つの層の間に白い層(タンパク質が含まれているらしい層)があり、水層(プラスミド含)を取り出す際にそれをピペットで吸ってしまったことが原因だったのかな、と思っているのですが、その根拠などもわかりません。

どなたかわかる方がいらっしゃいましたら、教えてくださると幸いです。

Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。

大腸菌のコロニーに
TE/RNaseA

NaOH(アルカリ変性させた)

NaOAc(中性に戻した 大腸菌のゲノム:ニックが入ってもとに戻らない、プラスミド:元に戻る)

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水層をとりだしてisopropannol加える

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の順で操作を行った後、電気泳動しました。

しかし...続きを読む

Aベストアンサー

バンドが薄くても検出されてるなら、学生実験ならまぁOKではないでしょうか。

 原因としては、エタノール沈澱洗浄の際、プラスミドまで吸ってしまったり、あるいはもともとサンプルに極端にプラスミドが少なかったりしたこと、あるいは上清分離の際にプラスミドあるいはゲノムの層を取る量が少なかったなどが挙げられるのではないでしょうか。

 あるいは電気泳動の際に、希釈でミスしてたりも考えられます。

 ご検証ください。

 

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

Qプライマーダイマーが出てしまいます。

PCRがうまくいきません。プライマーダイマーが出てしまいます。
鋳型DNAが少ないとできやすいと聞いた事があるのですが、鋳型はあまり
たくさんないので、増やす事もままなりません。
他に何か良い方法があったら教えて下さい。

Taqポリメラーゼを使っています。Hot Startしてもダメでした。

例えば、プライマーを減らしたりするのは有効でしょうか??

Aベストアンサー

いちばん確実でシンプルな解決策は、プライマーを変更することだと思います。プライマーダイマーができてしまうということは、自分がデザインした2ヶのプライマーに、相補的な配列があるということです。アニールしてしまうのですから、温度や濃度などのファクターを変更しても、やはりアニールは起きてダイマーをつくりかねません。頑張っても徒労に終わる可能性があるので、相補的な部分をつくらないように、プライマー配列をデザインし直すのが早いと思います。

QPCRの失敗について

PCR後電気泳動したんですが、
バンドが出てきません。
PCRって失敗することあるんですか?

単にプライマーとテンプレートを入れ間違えたんでしょうか?

テンプレートの前後にPCRによりタグ(Hisタグ、制限酵素サイト、転写促進配列など)を付けているのですが。

もし仮にテンプレートとプライマーが合っていない場合、テンプレートだけのバンドは出てきそうですが。
そうでもないんでしょうか?

Aベストアンサー

>PCRってちゃんと溶液を混ぜてもできないことあるん
>ですか。
もう決まった条件があるのならまずうまく行かないことはありません。ですから試薬やサンプルに問題がある可能性が大です。
ただし、ちがうPCRマシーンをつかうと条件が変わってくる可能性があるので出ない場合は再検討してみることも考えたほうがいいことがあります。同じメーカで同じモデルでも機械が違うと違うとおっしゃる方もいます。
あとうまくいった時に使用したのと同じ種類のポリメラーゼを使ってますよね。それも確認した方がいいかもしれません。逆手にとって、手元に違う種類の酵素があれば使ってみるのも手かもしれません。たまにメーカーが間違ったプライマーを送って来ることがあるという話も聞いたことがあります。本当かどうかよく分かりませんが、メーカーの人に確認してもらうというのも必要なのかもしれません。

Qプライマーのこと

プライマーで
「センスとアンチセンス」や
「フォワードとリバース」
と呼んだりすると思うのですがこの呼び方の定義はなんですか?

頭がこんがらがってしまってよく分からなくなってしまいました。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

センスは2本鎖DNAのうち、m-RNAのテンプレートとして機能するほうの鎖。
アンチセンスはセンス鎖と相補性のあるもう一方の鎖。
フォワードとリバースはPCRを行い際に、必要ですね。
センス鎖とアンチセンス鎖は5'と3'の方向が逆のため、
プライマーは逆方向のものを用意する必要がある。

QPCR法の結果のバンドで・・

人間の毛根からDNA抽出しPCRを行いました。
マーカーの分子量の一番多い上のバンドは同様に太く出たのですが、分子量の一番軽い方が線状でなくもやっと霧状に広がっているのですが何故なんでしょうか。
実験目的は、どのくらいとれているかというのが問題だそうです。それってマーカーが太ければ沢山取れてることになるんですか?また、DNAのバンドから、これは何のDNAだ。とか何のタンパク質を作るDNAのバンドだとかって分かるんですか。
そもそもマーカーのDNAはもともと長いものなのに、なんでバンドが並んで1本でなく数本出るのですか。

質問が多くてすみません。いまいちよく理解できないで困っています。教えてください。

Aベストアンサー

>分子量の軽い方のバンドは、分子量の一番多いバンドが綺麗にでたのに、霧状になって広がって(1.58~0.83kbのあたり全体に)でたのでしょうか?

人のサンプルは使ったことがないのですが、
RNAということはないでしょうか?

微生物の場合は500ベース付近にもやっとでるのですが
もしかするとひとだと大きいのかもしれない。

Q電気泳動の失敗

はじめまして

電気泳動の失敗例を探しています。

自分のバンドが何故でなかったのか
調べてるのですが…
分子量マーカーはちゃんとでたので
ゲルの問題ではないと思います。

出たのは「靄」みたいなので…ーー;

実験は

アガルースゲルの大腸菌を制限酵素で切断
エチシウムブロマイドで色を着け(色ではありませんが)
UVで照射し撮影しました。

どなたがご存知の方
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

制限酵素のSTAR活性かもしれません。
STAR活性のある制限酵素(EcoRIなど)を過剰に加えたり、反応時間が長すぎたり(オーバーナイトなど)すると、認識部位以外でも切断が起こって、DNAが靄状(スメア)になります。
経験者。

Qエクセルで片対数グラフを作る

エクセルで片対数グラフを作る方法を詳しく教えてください。お願いします。

Aベストアンサー

グラフの数値軸のところで右クリックして
軸の書式設定(O)→目盛(タブ名)

対数目盛を表示する(L)
にチェックを入れてください。

Qアガロースゲル電気泳動の失敗

作った1枚のアガロースゲルを使うレーン分だけ切り分けPCR産物を泳動したのですが、なにもでませんでした。先に使用したサンプルはマーカーもバンドも確認できました。
同じゲルで同じマーカーを使用したのに、なぜこんな事になったのでしょう??どなたか教えて頂けないでしょうか?宜しくお願いいたします。

Aベストアンサー

私の経験ではウェルに穴が開いていて,全部漏れ出ていた…なんてこともあります.切り分け作業のときにゲルがよじれてウェル下に亀裂が入っちゃったのかもしれませんよ.


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