293細胞の培養方法について

先々週に293細胞を起こしましたが（ストックは１年半ほど前のもの）、なかなか増えてくれません。ほとんんどの細胞が浮いていて、接着している細胞も塊のようになっている状態です。どなたか293細胞を使用したことがある方、培養のコツのようなものがありましたら教えてください。よろしくお願いします。
培地はDMEM（high glucose）、継代の時はPBS-EDTAを使用し、37℃,5% CO2のインキュベーターで培養しています。

No.1 回答者： MIYD 回答日時： 2007/04/23 21:51

培地の情報に書かれていませんが、

グルタミンやFBSは適した濃度やロットのものが入れられていますか？

撒きなおして細胞密度を上げて、
培地交換で死細胞を除いてみてはいかがでしょうか。

ストックが駄目になっているのならば、
貰いなおしたほうが早いですけどね。

この回答への補足

回答いただきありがとうございました。培地にはグルタミンもFBSも指定の濃度,lotで加えています。
アドバイス頂いた通りに、一度死細胞を取り除いた後に濃いめに撒き直してみたところ、細胞が接着するようにはなったのですが、今度は培地が赤→オレンジっぽく変色していました。黄色味がかってる感じです。これは細胞密度が高過ぎたためでしょうか？

補足日時：2007/04/26 11:13

No.2 ベストアンサー 回答者： ga111 回答日時： 2007/04/24 06:47

培地を死んでいると思われる浮遊細胞と一緒に除きます。

そのあと、塊のようになっている状態をピペッティングやトリプシンでやさしくばらばらにします（増殖を早めるため）。その細胞はそんな感じになるので心配要りません（あまり少ないとまずいが）。

あまり細胞濃度がうすくならないように数に応じて、小さいプレートやウエルにまきなおします（～30％密度くらい）。細胞が一部伸展していることを確認し、時間が許すならひたすら待ちます。

この回答へのお礼

回答いただきありがとうございました。今までトリプシンは用いず、PBS-EDTAのみで細胞をはがしていたのですが、なかなかバラバラになりませんでした。トリプシンを使用してみようと思います。

お礼日時：2007/04/26 11:24

No.3 回答者： ebikichi 回答日時： 2007/04/24 07:46

293はくっつきづらい細胞です。

起こしたら一晩触らずに放置しましょう。

フラスコは普通の培養用フラスコでも十分ですが、コラーゲンなどがコーティングされているものをご使用でしょうか？（期限が切れてませんか？）

培地はＦ１２かＤＭＥＭ／Ｆ１２がよく使われてませんか？
ＤＭＥＭでもよいとは思いますが。

ストックに失敗している可能性があります。
可能であれば親株を起こしてみましょう。起こすときはすばやくやりましょう。

浮遊培養できる細胞です。浮遊用の細胞およびフラスコを使用していませんか？

FBSは指定のlotをお使いですか？新しいlotではないですか？


などなどまだあると思いますが、思いつくまま書いてみました

この回答へのお礼

回答いただき、ありがとうございました。フラスコではなくシャーレで培養しています。high glucoseの培地は先輩が293細胞の培養を開始するにあたって購入したものです。またFBSもこの培地に合わせたlotのものなので、問題ないと思います。

お礼日時：2007/04/26 11:11