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これからネオマイシン耐性のプラスミドを導入してセレクションを行うために、プラスミド導入前の細胞がどの程度のG418濃度でアポトーシスが誘導される検討を行っているのですが、力価として3000 μg/mLまで濃度を上げましたが全然死んでくれません。

細胞は株化された血管内皮細胞なんですが、wakoの試薬情報では哺乳系細胞では100~2000 μg/mLとなっています。

今後、G418濃度を上げ続けてセレクションするのがよいのか、それともいっそのこと耐性遺伝子を変えてしまうのがよいのか迷っています。

どなたかアドバイスよろしくお願いします。

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A 回答 (3件)

ほとんどの細胞はある程度のG418を加えると、細胞分裂が遅くなります、経験上。


それを考慮にいれて1週間くらい継代なしで培養できるくらいの細胞数ではじめます。
しかし、あまりに少なすぎると、通常の濃度よりも低いところで死にやすくなりますのでご注意を。

もともと、遺伝子を導入した細胞をセレクションする場合、セレクションられた細胞が増えるまでの期間が2~3週間かかりますので、それを想定して1週間くらいで死ぬ薬剤の量を継代なしで検証する必要があります。

継代するとその行為で細胞が痛みますので、正確な検証ができません。
独学とのことですが、こういう実験はやったことある方に、実際に細胞を見せてもらいながら教えてもらうことが重要です。
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この回答へのお礼

>rnotk720さん、otxさん

色々とありがとうございます。

やはり初めての実験というのは、なかなかイメージがしにくく大変でしたが、ようやく遺伝子工学実験ノートなどの本に書いてある内容と、僕の中の実験のイメージがまとまってきました。

もしも、またわからないことがあったときはよろしくお願いします。

お礼日時:2009/04/15 16:08

まず最初に、あなたの行っているのは一般的にキルカーブと呼ばれるもので、ネオマイシンレジスタンスを持たない状態の細胞がどれだけのネオマイシンの濃度で死亡するかを測定するためのものです。



ここで気をつけなければいけないことがいくつかあります。
まず、ネオマイシン(G418)はすぐに効くものではありません。
最低でも1週間ないしは2週間の培養期間を与えた上で、90%近い細胞を殺すことのできる最低限の濃度を調べなければいけません。

また、G418は細胞分裂をしている細胞にしか効きません。ですから、もともと培養した細胞が多すぎた場合、G418はまず効かないと思ってください。

最後に、ごくまれにですがG418に元から耐性を持った細胞もいます。これらの細胞はキルカーブには使うことができませんので、ご注意ください。

実験うまくいくことを願っています
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3000はかなり高い濃度の気がします。


この濃度で何日ぐらい培養されたのでしょうか?
もし、この濃度で2週間以上アポトーシスが観察されないようなら、
私なら、G418を新しいものに買い換えてやり直すと思います。
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この回答へのお礼

実際に培養した日数は3日間なのですが、3日後のMTTアッセイの結果で細胞生存率が90-100 %(n=3)という結果でした。

一点教えていただきたいのですが、2週間以上培養するというのは、その間に系代培養を行ってもよいのでしょうか?

当研究室でセレクションなのどの操作は僕が初めて行っており、独学で検討しており、知識が追いついていないことがあるため、色々教えていただけると幸いです。

お礼日時:2009/04/14 14:47

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QDMEM培地について。

DMEM培地に含まれる

・グルコース
・L-グルタミン
・フェノールレッド
・HEPES

それぞれの効果というか意味を教えてください。

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

L-グルタミンについては、
http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8
「培地にL-glutaminの添加は必要ですか?どの程度のL-glutaminを添加したらよいですか?なぜ information sheetにL-glutaminの記載がないのですか?」
を見て頂けると良いと思います。
最終的にはどの培地にも添加されます。

参考URL:http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8

Qpoly-Aとは

poly-Aとはなんでしょうか?
あとpoly-A付加シグナルについても教えてください。

Aベストアンサー

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
この一時転写産物はイントロンを削除しエクソンを連結するスプライシング、5'末端に一個の7-メチルグアノシン(7-m G)を付加(cap構造といいます)するcapping、3'末端にpoly-A tailを付加するpolyadenylationを経て成熟mRNAになります。

poly adenylationは、最終エクソン内のAAUAAAという配列(polyadenylation signal ポリアデニル化シグナル, poly-A additional signal ポリA付加シグナル)を認識するpoly-A polymerase ポリAポリメラーゼによって行われます。この酵素はポリアデニル化シグナルの10~30塩基下流で一時転写産物を切断するとともに、鋳型に依存せずにアデニンを付加します。なお、ポリアデニル化シグナルには例外も知られています。

参考URL:http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW2/MG234.html

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
この一時転写産物はイントロンを削除しエクソンを連...続きを読む

Qコザック配列の必要性

実は、あるベクターにc-MycタグをつけてショウジョウバエのS2細胞で発現差背用としているのですが、その際にKozak sequenceは必要でしょうか?
文献等には、Kozak sequenceがあった方が細胞内でのタンパク質の発現レベルが高いとのことが書かれていましたが、実際にどれほどの重要性を占めているのか分かりかねています。
ただ、発現させるだけなら開始コドン(ATG)をつけておけばいいような気もしますが、どうなのでしょうか?
詳しい方がいらっしゃいましたら、ご教授願います。

Aベストアンサー

Kozak配列CCACCaugの中で、augの3塩基前がピリミジンになると翻訳がほぼ完全に起こらなくなるのだと記憶します。

ショウジョウバエではCavener (1987)が翻訳開始のコンセンサスを調査していて、
RNNaugで始まる例が95-98%であるのに対し、
YNNaugは2-5%で全く例外的、しかも
YNNaugYは全くない
という報告をしています。(R=プリン、Y=ピリミジン)
Kozak配列そのものである必要はないかもしれませんが、
YNNaugにしてしまうのは無謀といえるでしょう。

>挿入した遺伝子にもタグがついておらず
タグは発現させるタンパク質fusionにするものだと思いますが、C末端側につければ、入れた遺伝子がもつ本来の翻訳開始がそのまま使われるのでは。

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

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(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

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Qサテライトコロニー?について

こんばんは。
初めて質問します。よろしくお願いします。

大腸菌のトランスフォーメーション実験を行い、アンピシリンとX-gal染色によりセレクションしました。
白色コロニーをコロニーPCRにかけるために選ぶ際、指導者に、サテライトコロニー(?)は白色でも正しくトランスフォーメーションされていないことが多い、と言われました。
サテライトコロニーとは、1つの大きなコロニーのまわりに小さな飛び散ったようなコロニーが見えるもののことを指すらしいのですが。
なぜ、正しくトランスフォーメーションされていないのでしょうか?確かにコロニーPCRでは増幅されませんでした。
指導者はその理由は忘れてしまったそうです(-_-メ)
調べても中々わかりません。
どなたかご存知でしたら教えてください。
参考URLでもかまいません。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

サテライトコロニーは、形質転換体のコロニーによって、培地中の薬剤が分解されたために、形質転換されていない(つまり、プラスミドを持っていない)ものがコロニーを形成してしまう現象です。

プラスミド自体を持っていないので、β-ガラクトシダーゼ活性も持ちませんから、コロニーの色は白色となります。

ちなみに、サテライトコロニーは、アンピシリン耐性で選抜するときによく見られますが、アンピシリンの代わりにカルベニシリンという薬剤を使うと、サテライトコロニーの発生をかなり抑えられます。(カルベニシリンは、アンピシリンと比べるとかなり高価ですが。)

Qエクセル STDEVとSTDEVPの違い

エクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。
宜しかったら、恐縮ですが、以下の具体例で、『噛み砕いて』教えて下さい。
(例)
セルA1~A13に1~13の数字を入力、平均値=7、STDEVでは3.89444、STDEVPでは3.741657となります。
また、平均値7と各数字の差を取り、それを2乗し、総和を取る(182)、これをデータの個数13で割る(14)、この平方根を取ると3.741657となります。
では、STDEVとSTDEVPの違いは何なのでしょうか?統計のことは疎く、お手数ですが、サルにもわかるようご教授頂きたく、お願い致します。

Aベストアンサー

データが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。また母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。
で標本データの時はSTDEVを使って、母集団の時はSTDEVPをつかうことになります。
公式の違いは分母がn-1(STDEV)かn(STDEVP)かの違いしかありません。まぁ感覚的に理解するなら、分母がn-1になるということはそれだけ結果が大きくなるわけで、つまりそれだけのりしろを多くもって推測に当たるというようなことになります。
AとBの違いがあるかないかという推測をする時、通常は標本同士の検証になるわけですので、偏差を余裕をもってわざとちょっと大きめに見るということで、それだけ確証の度合いを上げるというわけです。

Qグリセロールストックについて?

学生時代、大腸菌をグリセロールストックすると保存状態が良く長期間保存できる?という事をを教わったような記憶があります。なぜ普通に凍結するより状態が良いのでしょうか?理由とグリセロールストックの操作方法を教えて下さい。又、大腸菌以外の微生物にも有効なのでしょうか?教えて下さい。お願いします

Aベストアンサー

細菌類ならなんでもできると思います。
細菌を培養した液を保存用の小さいチューブに移し、グリセロールを加えて冷凍し(液体窒素やドライアイスなどで急速冷凍するのが望ましい)、マイナス80℃のフリーザーで保存します。半永久的に保存できます。グリセロール濃度はものの本や各メーカーから提供される形によって15-50%と幅がありますが、濃度が低めのほうが再融解しにくく持ちが良いように感じます。
使用するときは、凍結したまま少量を削り取って培地にまきます。

ちなみに、生物学研究で用いられるモデル生物のひとつ、線虫もグリセロールストックします。

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

Qプラスミドの制限酵素処理

プラスミドを作る時、制限酵素で切断しますよね。切断したサンプルは電気泳動をして、目的のサイズの部分のゲルを切り出して精製して、ライゲーションするわけですが、セルフクローニングがたくさん出てしまい、なかなかうまくいきません。
2種類の酵素で処理(切断部位が近接(数~数十bp))していて、脱リン酸化処理はしていません。2カ所で切断されていれば、脱リン酸化にかかわらず、セルフライゲーションは起こらないはずだと思うので。
だとすると、どちらか一方の酵素でしか切断されていないものが多いことが原因だと思います。1カ所切断と2カ所切断のサイズが同じぐらいであるため、分離するのは難しいと思うのですが、何かよい方法、アドバイスはありませんでしょうか?

Aベストアンサー

サブクロしていて一度はみんな経験するトラブルですね。
こんなとき、理屈をいろいろ難しく挙げられる人もいるのですが、
質問者さんも百も承知であると思われるので、
私はこれまで、こういうトラブルを乗り切って
後から考えるとうまくいかなかった理由はこうではないかという
実体験を書かせていただきます。

私の場合、こういうときに脱リン酸化処理が
劇的に問題解決に結びついたことはあまりないいんですよね。

一度、ベクターを2つの制限酵素でカットしてゲル切り出しするときに
面倒だったので、大量のDNAを1レーンに泳動して切り出して、
最後に切り出して抽出したDNAを泳動して確認したときなんですが
ちゃんと切り出したにも関わらず、切れていないベクターと思われる
バンドが確認されたことがあるんです。
このとき、勝手な想像で、
カットされたベクターが多量にありすぎて、
カットされていないベクターを引っ掛けて(巻き込んで)
泳動されたのかなぁと思い、1レーンあたりのDNAを減らすために
1レーンで流した量を10レーンに分けて泳動して回収したところ
1レーンに多量のときとほぼ同じ量が回収でき
かつ、切れ残りと思われるバンドも見えなくなりました。
なんでこうなったか理論はよくわかりませんが、
私の中では迷信かもしれないけど難しい理論より経験が大事だと思った
次第であります。

もし心当たりがおありでしたらお試しあれ。

また、理屈よりもクローンを取ることが大事だと思うので、
どなたかが書かれていましたが、時には力技も必要かもしれません。
私も重要度にもよりますが何度か四の五の言わずにやりました。

サブクロしていて一度はみんな経験するトラブルですね。
こんなとき、理屈をいろいろ難しく挙げられる人もいるのですが、
質問者さんも百も承知であると思われるので、
私はこれまで、こういうトラブルを乗り切って
後から考えるとうまくいかなかった理由はこうではないかという
実体験を書かせていただきます。

私の場合、こういうときに脱リン酸化処理が
劇的に問題解決に結びついたことはあまりないいんですよね。

一度、ベクターを2つの制限酵素でカットしてゲル切り出しするときに
面倒だった...続きを読む


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