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total RNAを組織から抽出し、RNase-free水に溶解し、-80度で保存しています。今後、このRNAを使って実験をしようと思っているのですが、、、RNAがどれくらい温度に対して安定なのか心配しています。というのも、今後、実験のたびにRNAを冷凍庫から取り出し、必要な分量を分抽した後、再び冷凍庫へ返すといったことを繰り返すからです。RNAにお詳しい方がいらっしゃいましたら、(1)RNAの熱安定性について(2)一般的なRNAの保存法とその注意点(3)冷凍→分抽→冷凍の繰り返し作業についての意見およびより良い方法、の3点について教えていただけないでしょうか?よろしくお願いします。

gooドクター

A 回答 (2件)

ボイルするとか、オートクレーブするとかめちゃくちゃな加熱でなければ、RNAが特に熱に弱いということはないと思います。

ただし、RNaseのコンタミや過剰の水酸化物イオン、水素イオンがある場合(つまり適当なバッファリングをしていない場合)、温度が高いと加水分解を促進してしまうでしょう。

水溶液をディープフリーザで凍結保存している限り安定なはずですが、凍結融解を繰り返すのは確実に分解が進みますから(いろいろな要因があるでしょうが、一つには氷の結晶が生じるときに高分子に剪断力がかかる)1回分から数回分の使用量で小分けにしましょう。

しばらくむかしは、RNA水溶液に対して3倍量のEtOHを加えて-20℃、あるいは-80℃で保存するのが一番安心だといわれていました。このRNAのアルコール溶液を必要量とって、塩を加えEtOH沈殿してサンプルとしました。

現在のトレンドは、RNAを脱イオンしたフォルムアミドに溶解して-20℃で保存する方法です。フォルムアミドでRNAが安定化され、凍結しないのでハンドリングが容易、多くの目的ではフォルムアミド溶液そのままで使用できます。必要な場合はEtOH沈殿で溶媒交換します。
参考文献↓
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.f …
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(1) RNAの熱安定性について詳細な情報は持ち合わせていませんが、


例えばRNAを化学的に分解する際には、
pHを9にして60℃で数分~数十分加熱する処理を行います。
ですから通常の溶解状態では、熱安定性は気にする必要はありません。

(2) RNAaseやバクテリアのコンタミが最も恐ろしいので、とにかく分注して保存します。
冷凍保存しますが、凍結融解の際に物理的な切断が起こり得ますので、
これを避けるため50%EtOH溶液として-30℃程度で保存、
あるいEtOH沈殿の状態で-80℃で保存します。
お持ちのRNAの量によりますが、-30℃と-80℃に数本ずつストックされると良いと思います。

(3) 日常的には-30℃のストックを使用します。
それが尽きたら-80℃のストックを50%EtOH溶液に調製し直して同様に使用します。
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