No.2ベストアンサー
- 回答日時:
♯1です。
タッチダウンPCRとステップダウンPCRは同じ意味で用いられていることが多いようです。すみません。
先ほどの回答のtouch-down PCRの例は、一般的に2ステップPCRと呼ばれているようです。
ステップダウンPCR(タッチダウンPCR)では、伸長温度(アニーリング温度)を徐々に下げていき、最終的に目的温度まで下げます。
それは、先ほどの回答に示したとおりですが、その下げ幅は、0.5℃とかのように小刻みにする人もいるようです。
No.1
- 回答日時:
Long PCRとか、Tmの高いプライマーでPCRするときの話でしょうか。
この場合、プライマーのTm値が70度前後の場合が多いと思います。
touch-down PCRではアニーリングの低温のステップを省き、Predenature (94℃)1サイクル後、
↓
Denature (98℃)
Extention (68℃や72℃)
を25~40サイクル
↓
予備伸長68℃や72℃
というような感じだと思います。
変性denatureと伸長extention(プライマーのTm値が高いのでアニーリングannealingも同時に行える)の2ステップで行います。
step down PCRでは非特異的な断片を極力さけるために、
はじめはExtention温度を高めに徐々に下げていきます。
KOD系のLong PCRの場合、以下の感じのようになります。
プログラムとしては長いです。
Predenature (94℃)の後、
↓
Denature (98℃)
Extention (74℃)
を5サイクル
↓
Denature (98℃)
Extention (72℃)
を5サイクル
↓
Denature (98℃)
Extention (70℃)
を5サイクル
↓
Denature (98℃)
Extention (68℃)
を15~25サイクル程度
↓
予備伸長68℃
Long PCRの際のTm値は、最近接塩基対法で求めたものの場合が多いと思います。
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