細胞数の経時的な数え方

かなり初心者です。
ある細胞に薬剤を添加して増殖抑制がかかるかどうかを、経時的に追いかけています。
未処理のコントロールに対する生存率だけでなく、細胞の絶対数の経時的な変化も知りたいので、96ウェルプレートに撒いて2日おきにMTTアッセイを行なっています。
しかし、この方法ですと毎回細胞数をヘモサイトメーターで測って、標準曲線を立てる必要がありますが、このヘモサイトメーターで細胞数を数えるところが結構アバウトで、検量線が毎回ずれているような気がして仕方がありません。こういう実験をする時は、他の方法で細胞数をカウントする方が良いのでしょうか？何か良い方法はありますか？ヘモサイトメーターで数を数えるのは、慣れればかなり正確に出来るものなんでしょうか？
何分数が多いので、なるべく簡便な方法でカウントしたいと思っています。
よろしくお願いいたします。

No.1 回答者： Dr_Hyper 回答日時： 2007/10/26 01:18

実験系があっているのか、すこし不安になる表現もあるのですが、だいじょうぶですよね。

要するに細胞をカウントして実験をしているが、そのカウントが安定しないので、撒いた数が安定せず薬剤の効果をみているのか実験的誤差を見ているのかわからないと解釈してよろしいでしょうか？
ヘモサイトメーターでも、他のカウントのしかたでも、スケールとそれに適正な細胞数のレンジがありますよね。
血球算定盤でカウントするときだって、１００前後をカウントするのと　1～10コや10000以上をカウントするのでは、信用度は変わってきます。それは機器を等しても同じで、96 wellにまき直すときも、その前の段階で細胞をカウントするときの希釈が一番のポイントです。
カウントの方法というよりは、安定した実験系をつくれているかに疑問をもちました。

この回答への補足

薬剤の効果をみているのか実験的誤差を見ているのか不安という意味ではまさにその通りです。
こうした試験の場合、一般的に取られる手法なりご教示頂けますと、大変ありがたいです。
よろしくお願いいたします。

補足日時：2007/10/26 09:48

この回答へのお礼

経験者のご意見、誠にありがとうございます。
勉強させていただきます。
”実験系があっているのか、すこし不安になる表現もある。”という事なのですが、具体的にどの辺りの記述なのかご指摘頂けますと大変幸いです。
実は紆余曲折があって、全く慣れない分野の実験をする事になってしまい、試行錯誤中です。
本来ならよく知っている方に直接アドバイスを求めるところなのですが、分野違いで知っている人がなかなかいないという事もあるのですが、諸般の事情で外部に意見を求める事はし難い状況です。
もし私ならこうするといったようなご意見・アドバイスあるいは参考になる書籍でもありましたら、是非是非よろしくお願いいたします。

お礼日時：2007/10/26 09:48

No.2 ベストアンサー 回答者： Dr_Hyper 回答日時： 2007/10/26 16:50

具体的な細胞数など教えてもらえますか。

カウントした細胞数、plateに撒くときの濃度など。。。

あとMTTアッセイで大丈夫なんでしょうか？
薬剤がミトコンドリアなんかをターゲットにしたりしてませんか？
一般にはMTTアッセイで細胞の増殖を検定しますが、どうも生存率も気にされているようなので、ちょっと気になりました。
controlの細胞がMTT assayだと順調に増殖たようにグラフがかけないと理解して良いですか？

この回答へのお礼

お世話になっております。
再度のご回答、誠にありがとうございます。

具体的な細胞数なのですが、96穴プレートに捲く細胞数は大体3000cell/well(100uL)程度になるように調製して、各n=8で捲いています。
ヘマサイトメーターは大体1区画100Cell程度を4区画分で、その平均値を取って、その数値を元に検量線用の細胞を調製しています。

質問では一般的な名称と思いMTTアッセイと書いてしまいましたが、実際にはこれと似たような原理のキットで細胞内の脱水素酵素で還元される基質による発色度合いを見るものです。マニュアルに化学物質の感受性試験に使われるという記載がありましたもので。

薬剤で処理すると、非処理に比べてどの程度増殖スピードが抑制されるのかを比較したかったので、仰る通り生存率というのは間違った言い回しでした。生存率ではなくて非処理(Control)と比較した時の相対的な割合です。

心配なのは、control細胞は増加するグラフは得られているものの少々がたついているので毎回立てている検量線が本当に正確なのかという点と、本来ならプレートに一様に捲いてから薬剤処理をするのが良いのでしょうが、実験上の都合で別々のDishで培養した処理／非処理の細胞をヘモサイトメーターで数えてプレートに捲くという工程を入れているので、スタートの時点で両者の細胞数に結構違いが出てしまっているのではないかというこの2点です。

要はどちらもヘモサイトメーター絡みの事ですが、どれほど正確に数をカウント出来ているのか、許容な誤差範囲はどの程度なのかという点と、こういう実験の場合、こういうカウントの仕方で妥当なのかも少々不安に思って質問させて頂きました。
長文、大変失礼いたしました。
よろしくお願い致します。

お礼日時：2007/10/27 01:42