植物のプロトプラストを用いた細胞死検定について。

現在、植物のプロトプラストに、すでに細胞死を誘導すると分かっている遺伝子を導入し、エバンスブルー染色によりその細胞死の確認を行っています。
今後は細胞死を誘導するであろうと予想される遺伝子を片っ端から導入し、細胞死を観察することでスクリーニングを行おうと思っています。
現時点では、遺伝子が導入された細胞をピンポイントで見つけ、その生死を確認するために同時にGFPを導入し、顕微鏡で観察しようとしています。
しかし、ポジコンの実験においてGFPの蛍光が観察される細胞が少なく、始めは導入効率が悪いのかとも思ったのですが、明視野で確認するとエバンスブルーで染まった細胞がいくつもあったのですが、何度繰り返して確認しても青く染まったプロトプラストにおいてGFPの蛍光が観察できませんでした。
そこで質問なのですが、GFPを導入した細胞をエバンスブルーで染色するとGFPの蛍光は観察できなくなるのですか？（青く染まった細胞は自家蛍光すら見えず蛍光観察下で真っ暗に見えたので）
もしくは、GFPが発現していても細胞死が起きると蛍光が観察されなくなるのですか？

詳しい方いましたら教えてください。

また、プロトプラストの細胞死検定において遺伝子が導入された細胞を的確に見つけ細胞死の有無を確認できる方法があれば教えて下さい。
よろしくお願いします。

No.5 回答者： tomi-chan 回答日時： 2008/04/21 21:50

こんばんは。

プロトプラストに励起光をあててGFPの蛍光を観察する場合ですと、「その時点でのGFPの発現」は確認できるかもしれませんが、後に確認したい細胞死が、導入遺伝子によって誘発されたのか、それとも励起光照射がそのトリガーになったのか検証が難しいと思います。

注目していらっしゃる遺伝子のプロモーターの機能（何時、どの組織で、どんな時に転写が促進されるか）にも注目した方が良いと思います。

励起光を当てずにGFPの自家発光を観察する場合は、培養が可能なプロトプラストなら、カルスを得ればコロニーからの緑色の光を観察できるかも知れません。

No.4 回答者： tomi-chan 回答日時： 2008/04/19 09:29

おはようございます。

以下はご質問への答えではなくなってしまいますがお許しください。

呈色あるいは蛍光とタンパク質の存在との対応は、得られるプロトプラストの量が十分ならウェスタンをしてみれば確認できると思います。

導入効率・発現の確認はサザン・ノーザンをしてみるのがよいと思います。

注目していらっしゃるアポトーシス誘導に関わっているであろうと思われる遺伝子のプロモーターを、デリーションアナリシスなどにより解析し、その機能も調べておいた方が良いかもしれません。

転写調節のメカニズムが明らかなプロモーターと、注目していらっしゃる遺伝子をつなぎ合わせたリコンビナントを導入し、発現のタイミングをコントロールできるようにしておくと確認しやすいと思います。

No.3 ベストアンサー 回答者： otx 回答日時： 2008/04/19 05:24

まず、GFPは出来てしまえば生物活動がなくても光ります。

私はGFPを発現させた細胞をすりつぶした溶液を励起光を当てて光らせて遊んでいますし。
また、明らかに死んだ細胞でもGFPが死ぬまでにある程度発現していれば光って見えます。私は見ています。
GFPは励起光を当てて光らせるものです。No1様がおっしゃることはまったくのでたらめです、言葉は悪いですが。

質問者様の実験の組み立てでひとつ疑問なことがあります。

アポトーシスを誘導する遺伝子というのは、発現してどのくらいでアポトーシスを誘導すると想定されているのでしょうか？
また、その遺伝子はどのくらいの発現量でアポトーシスを誘導するとお考えでしょうか？

成熟GFPができるまでとNo2様はおっしゃっていますが、それ以前に
蛍光を観察できるようになるまでに、ある程度の発現量で光の強さを確保しないとGFPも観察できません。
GFPが観察できるレベルの発現量なるまでに、アポトーシスを誘導する遺伝子は十分アポトーシスを誘導しているとすれば、GFPはあってもアポトーシスを起こした細胞では観察できないと思いませんか？
アポトーシスを起こせば遺伝子発現は起こらないと思いますし。

私はポジコンでアポトーシスを誘導する遺伝子とGFPを同時に導入する実験とやるときに、ネガコンでGFPのみを導入した細胞を用意してみれば一目瞭然だと思うのですが。

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
確かに細胞死が誘導されることで十分にGFPが蓄積せず見えていない可能性があると自覚しています。
実際に細胞死を誘導する遺伝子は導入後６時間くらいから発現するんですが、早期に細胞死が起きるために十分なATPが供給されず、翻訳されていない（リアルタイムRT-PCRでｍRNAの量は十分あることを確認しているので）可能性を考えています。
そこで、次はプロモーターを変えて実験を行う予定です。
十分にGFPを発現させてから細胞死を誘導するために、GFPはユビキチンプロモーターのままで、細胞死を誘導する遺伝子をＤＥＸ誘導性プロモーターに変更して行う予定です。

お礼日時：2008/04/21 21:14

No.2 回答者： guragura77 回答日時： 2008/04/18 18:31

エバンスブルーの励起スペクトルを見ると、470nmと540nmにピークを持ち400-600nmあたりの波長の光を吸収するようですから、GFPの蛍光(~510nm)は吸収されてしまっているのではないでしょうか。

自家蛍光も見えないという事なので、この可能性が高いと思います。

こっちはあまり根拠のない話なので読み飛ばしていただいても結構ですが、GFPの発現ベクターを導入しても蛍光を発するGFPができるまで半日から一日くらいかかるようです。もしかすると、細胞死がそれより速く起こってしまうと成熟したGFPができないという事もあるかもしれません。

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
GFPの蛍光がエバンスブルーによって見えていない可能性があるんですね。
細胞死検定を再度検討する必要があるみたいですね。

お礼日時：2008/04/21 21:01

No.1 回答者： tomi-chan 回答日時： 2008/04/16 22:55

こんばんは。

GFPは励起エネルギーが供給されなければ光を発しません。外から励起光を当てて蛍光を得るわけではないので、ターゲット細胞での生物活動が停止した状態では、発光は観察できないと思います。

これに対し、例えばGUSをレポーターとしてお使いになる場合は、タンパク質（βグルクロニダーゼ）さえ発現していれば、青い色を確認できます。

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
説明不測でしたが細胞の観察については蛍光顕微鏡を用いています。
GUSについても検討してみます。

お礼日時：2008/04/21 20:53