DNAシークエンサーでの配列分析における，ピークの出方について

私は植物のゲノムDNA解析を行っています．
以下の操作を行っています．
１．ゲノムDNAのサンプル（RE未処理）をPCRし，目的バンドをQLA-quick gel Extraction Kit(GLAGEN)を用い，ゲル抽出する．
２．BIg Dye Tm terminator cycle sequencing kit ver.3.1を用いて，ABI PRISM　TM 310 Genetic Analyzerで配列分析を行った．
（ここでは，アニーリング温度をPCRのときのアニーリング温度と同じ，1度高い，1度低いに設定しシークエンス反応を試した．）

ここからが質問です．
１．配列分析結果において出てきた波形が，さまざまな波形が重なっていて一つのきれいなピークが出ていない．
２．後半部の方が急にピークが出なくなっている．
です．
どのようにしたら改善できるでしょうか？
よろしくお願いします．

No.3 ベストアンサー 回答者： teru-arai 回答日時： 2008/12/02 20:31

＃２です。

＞現在使用している解析機のプロトコルによれば、データに関してはシグナル
＞強度をピークポイント数として表しています。シグナル強度が高いものは値
＞が最大1300程で表示されます。自分のシーケンスデータだと、300～500未
＞満の値しか確認できませんでした。若干確認できるGの幾つかには、中途半
＞端に1000前後のピークポイント数は確認できます(解析不能データなのであ
＞てにはなりませんが)。
　
　ちょっと前に書いたばかりですが、シークエンスが読めないケースは主として３つあります。
１．シグナルが弱すぎる。
要するにものがないからと思われます。原因はエタ沈失敗、酵素失活、何かを入れ忘れ等々、多数。
２．シグナルが強すぎる。
シークエンサーには解析できるシグナル強度の上限があります。それを超えるとうまく解析出きません。このときはサンプルを希釈すればすぐはかれます。
３．シグナル強度は適正範囲。
この場合、シークエンス反応、エタ沈等問題ないはずで、普通は読めるはずです。読めないのは、波形がいくつか重なっているためと思われます。つまり、元のDNA にコンタミが多いあるいはシークエンスPCR反応時のプライマーの特異性が低い等が考えられます。

我々は、アップライドバイオシステムの310を用いています。シグナル強度は装置のコンピューターで波形データをプリントすると右上に書いてあります。３１０ですと、読めるシグナルの範囲は下限が100くらい、上限が1500～2000くらいです。
質問者さんの装置の上限下限が解りませんが、３１０と同じだとすると、300～500は（３１０なら）ばりばりに読めるはずの値です。ものは充分にあるわけで、エタ沈等での失敗ではないと思います。
考えられる対策は、１）サンプルDNAにコンタミが多いので、TAクローニングしてからシークエンスする、あるいは、２）おっしゃっているとおり、シークエンスPCRのアニーリング温度を上げてみる等があります。
私にはサンプルDNAにコンタミが一番怪しく思えます。質問者さんの教授殿がおっしゃられるとおりTAクローニングすれば読めるのじゃないですか。

No.4 回答者： teru-arai 回答日時： 2008/12/02 22:02

teru-araiです。

済みません、下、貼り付ける場所を間違えました。ご迷惑と思いますが、消せないものですから、申し訳ありません。お詫びいたします。

No.2 回答者： teru-arai 回答日時： 2008/11/29 03:30

　波形が重なって読めない原因は、＃1さんが言ってるようなこともあるのでしょうが主たるものは３つです。

一つはシグナル強度が弱すぎる時、二つ目が強すぎる時、３つ目はコンタミDNAの影響。ゲルからバンドを切り出しているということなので、コンタミは一応除外します（大腸菌からプラスミドをとってきてシークエンスするときに、大腸菌のゲノムDNAのコンタミがかなりあるとすごいですよ）。
シグナル強度ですが、波形データをプリントすると上のところに、ATGCおのおののシグナル強度が印刷されていると思いますが、その値はいくらになってますか？　
もしプリントしてないなら、装置で波形を呼び出して調べてください。Applied Biosystems社の310だと下に並んでいるボタンの一番先頭、アルファベットが書いてあるボタンを押して、条件シートを呼び出してください。ロールしていくと下の方にシグナル強度が書いてあります。
装置の種類によって異なると思いますが、310だと波形がきれいに分離できるシグナル強度の上限は1500から2000、下限は100か200くらいです。弱いときはどうにもなりませんが、強すぎる時はそのサンプルを希釈するだけですぐはかれます。
それから、途中で急激に弱くなるのは、確かによく見ますね。ただ、うちのラボでは未だかって見たことはありませんので（１０年以上やってますけど）、ちょっと、原因は分かりかねます。
あと、ここで訊くより、Applied Biosystems社の技術に波形データを送って訊いた方が確かですよ。

この回答へのお礼

ありがとうございます．
今うちの研究室の装置が故障しているため，大学共通の装置を使用して解析してもらって，そのデータを，sequencher TM 4.1で見ています．

ここで見れる波形でシグナル強度を見ようとしたのですが，わかりませんでした・・・
しかし，Applied Biosystems社の技術に波形データを送って見ようと思います．

読めている人は読めているのに・・・私のテクニカルな問題もあるのかなと思いますが・・・どうにかしたいと思います．

お礼日時：2008/11/30 09:25

No.1 回答者： Kohntarkosz 回答日時： 2008/11/28 12:26

波形が重なるのはプライマーの特異性が低い、もしくは遺伝子のコピー数の関係でゲノム中に何カ所かアニールする部位があるためと考えられます。

プライマーを変えてみましょう。
後半のピークが減衰するのは鋳型DNAが多いためだと思われます。量を減らしてみましょう。

この回答へのお礼

ありがとうございます．プライマーを変えてやってみます．
ほとんど単一バンドに近いバンドをゲル抽出して，シークエンスリアクションしても，このようなことが起こるのですね．．．
（私に知識がないからそう思うだけかもしれませんが．．．）

お礼日時：2008/11/28 12:46