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 遠心分離をする際に、7000×g・10分間、105000×g・60分間などというような記述がありますが、遠心機の回転数はどのように決めているのでしょうか。
 分離遠心法の場合、沈降係数(S値)の違いで成分を分けています。遠心にかける時間は沈降係数(S値)とKファクター(K値)で決まってきて、沈降時間=S/Kです。KファクターはN(遠心機の回転数rpm)の関数で、遠心機の回転数が大きいほど沈降時間は短くなります。
 私は、回転数は遠心機の最大回転数にすれば、沈降時間が短くなり、実験が早く終わるので、常に最大回転数にすれば良いのではないかと思うのですが、何故回転数を変えて遠心機にかけているのでしょうか。
 回転数が高すぎると、細胞構造が破壊されるからといったような問題があるのでしょうか。もし、そうでしたら、目安みたいな回転数はどここかで参照できないでしょうか。たとえば、何回転以上に設定するとタンパク質が壊れる、何回転以上に設定するとグリコーゲンが破壊される、何回転以上させると細胞内小器官が破壊される・・・などです。
 文章が長くなりましたが、ご存じの方いらっしゃいましたらお教えください。よろしくおねがいいたします。

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A 回答 (5件)

問題の本質部分については解答が出揃っていると思います。


それ以外の部分について、、、。

回転数を大きくすると生じる問題
1、チューブの限界耐圧を超えて、チューブが割れてしまう。
2、回転にはぶれがあります。特に回転初期の場合に気をつける必要があります。
ぎりぎりで設定すると排除したいものも沈殿する可能性が高くなります。
3、得られたペレットが硬すぎて、次の実験に使えない。
次の段階で再溶解させる必要がタンパクの実験の場合多いと思われます。

単に実験を円滑に進めるためで、本質部分には触れていませんが、
こういった作業性に関することはプロトコルの中で大きな位置を占める場合が多いです。

ご参考までに。
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沈降係数の式をどこかで見つけられませんか?


沈降係数を大きく左右するのは沈降させたいものの半径です。
生体試料だと希釈率によって溶液の比重、粘性が変わってくるのでこれも影響します。さらにショ糖などをくわえて積極的に比重を上げてやるとその比重より大きいもの以外は浮いてしまいます。これを利用した密度勾配遠心法もあります。

ブラウン運動により、ある程度以下の分子サイズのものは静置してもいつまでも沈殿しません。なので、小さいGで長時間、例えば理論値の時間遠心しても目的のものが沈殿するとは限りません。

沈殿を回収したい時、沈殿がどの程度硬いかによって操作が変わります。硬い沈殿ならデカントで上精を除くことが出来ますが、やわらかい場合はピペットなどで静かに除きます。このペレットの硬さは時間よりはGによって調整するものですが、理論値はあまりないでしょうね。沈降するかどうかは結構理論計算できますよ。

細胞は確かにGを掛けすぎると死にますね。ただ、壊れるという表現はもう少し慎重に使った方がいいと思います。細胞が沈殿した後、強いGが掛かれば細胞の中で細胞内小器官が偏ったりして壊れる部分があるでしょう。グリコーゲンだと、どんな力が掛かると壊れるか?遠心では壊れないような気がします。
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細胞やタンパク質等にしてもその種類によって影響が大きく異なると思いますし、溶媒、夾雑物の種類や量、ローターの形状(アングルローターとかスイングローターとか)、チューブの材質や形状、温度、目的とする純度や収率等、多数の要因が影響するので、なかなか一般化した基準というのは作りにくいのではないでしょうか。



大抵のプロトコルでは遠心分離をする必要がある場合には必ず回転数(またはg)や時間の記載があるので、まずそれを試してみてうまく行かない場合は条件を再検討してみてはいかがでしょうか。細胞が死んだ場合やペレットが再懸濁できないほど固まった場合は回転数を落とす、沈殿が緩すぎる場合には回転数を揚げる、等々。

類似した目的のプロトコルを複数参照すれば、最初に試みるべき条件のイメージはだいたい浮かんでくると思います。
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この回答へのお礼

やはり理論だけでは明確に分からないものなのでしょうか。
類似したプロトコルを参照しながら、アタリをつけて
回転数と時間を決めていかなければならないのですね。
なにか、物質ごとに回転数と遠心時間がまとまったグラフや表みたい
なのがあれば便利なのですが、そういったものはあるのでしょうか。

お礼日時:2009/07/05 04:39

基本的なことを理解しているようですので、もう少し調べれば分かるんじゃないかと思います。



逆に考えてみてください。遠心ではなく静置で、時間さえ掛ければすべてのものが沈降するのでしょうか?

少し発展させて、105000xg60分で沈殿させたものを、例えば20000xgで理論値の時間回すと同じように沈殿するでしょうか?

この回答への補足

確かに、
105000×g60分で沈殿させたものを、20000×gで理論時間回すのでは、
105000×gで回す方が、試料へのダメージが大きそうな気がします。
資料へのダメージと回転数のバランスが重要ではないかという気が
してきます。
ダメージと回転数の目安というのは何かあるのでしょうか。
明確なものでなくても、タンパク質なら何回転以上させては
いけない、糖なら何回転させてはいけない、といったような
感じのものです。

補足日時:2009/07/05 04:31
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何の遠心分離で(細胞?タンパク質)、どのような溶液中の、何を分離するための条件を想定して、おっしゃっているのでしょうか?


なんの場合でも、ためしにMAXスピードでやってみたことありますか?
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この回答へのお礼

 学校の実習でやった実験なので、指示書に書いてある手順通りに
遠心機をまわしただけですので、ためしにMAXスピードでやってみたことはありません。
 実習では、ラットの肝臓からグリコーゲンを分離するような実験を行いました。
 やはり回転数というのは、ためしにやってみて適した回転数を見つけるという地道な作業が必要なものなのでしょうか。
 説明不足でした。すみません。回答よろしくお願いいたします。

お礼日時:2009/07/04 00:01

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Q遠心分離の回転数について

食品を遠心分離して、固層と液層に分けたいのですが、遠心分離機の回転数(rppm)と時間はどのように設定したらよいのでしょうか?
回転数は試料重量に対して決めるものなのでしょうか?
ちなみに1本のチューブに入れる試料の重量は50~60gです。
バゲットは8個あるので、2本で回すときもあれば8本で回すときもあると思います。
時間は5分くらいでできればと思っています。
種類にもよりますが、試しにやってみた場合、3000回転5分では少し足りないようで、4000回転5分では十分すぎるような気もしました。

アドバイスお願いいたします。

Aベストアンサー

>回転数は試料重量に対して決めるものなのでしょうか?
それもありますが、比重(密度)の差が大きいでしょう。それに親和性が高い(乳化していたりする)と非常に困難になりますから、一概には言えず、経験が物を言う場合が多いです。
大きな装置をお使いですね、我が社ではもう見られなくなりました。
m(_ _)m

Qrpmをgに変換する方法(遠心分離機)

rpmをgに変換するには回転半径が必要になるそうですが、
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私のやりたい遠心操作は例えば『600×g』というような操作なので、
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Aベストアンサー

円運動の加速度a[m/s^2]は、中心方向に
a = rω^2 [m/s^2]
となります。遠心力f[N]は物体の質量をm[kg]として、
f = mrω^2 [N] ・・・(1)
となります。
ここでω[rad/s]は角速度で、1秒間に回転する角度[rad]、r[m]は回転半径です。

1分間では60ω[rad]回転しますので、この値を1周の2πで割った値が[rpm](1分間あたりの回転数)の値となります。
A[rpm] = 60ω/2π
これを式変形して、
ω[rad/s] = 2πA/60
となります。

これを(1)へ代入して遠心力は
f = mr(2πA/60)^2 [N]

となり、この力を質量で割った値が加速度aになるので
a = f/m 
  = r(2πA/60)^2 [m/s^2]
  = r(2πA)^2 / 360 [m/s^2]

となります。これが、重力加速度g(=9.8[m/s^2])の何倍にあたるかをあらわしたものがN[G]ですので、
N = a/g
  = r(2πA)^2 / 360g
  = r(2πA)^2 / 3528 [G]
となります。

以上の式からわかるように、[rpm]を[G]に変換するためには回転半径r[m]が必要になります。単位がメートルですので(センチ、ミリではありません)注意してくださいね。

【計算例】

r=10[cm]、A=100[rpm]で計算すると、
N ≒ 10[G]

r=10[cm]、A=10000[rpm]で計算すると、
N ≒ 10万[G]


となります。

円運動の加速度a[m/s^2]は、中心方向に
a = rω^2 [m/s^2]
となります。遠心力f[N]は物体の質量をm[kg]として、
f = mrω^2 [N] ・・・(1)
となります。
ここでω[rad/s]は角速度で、1秒間に回転する角度[rad]、r[m]は回転半径です。

1分間では60ω[rad]回転しますので、この値を1周の2πで割った値が[rpm](1分間あたりの回転数)の値となります。
A[rpm] = 60ω/2π
これを式変形して、
ω[rad/s] = 2πA/60
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Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

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動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Qエクセル STDEVとSTDEVPの違い

エクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。
宜しかったら、恐縮ですが、以下の具体例で、『噛み砕いて』教えて下さい。
(例)
セルA1~A13に1~13の数字を入力、平均値=7、STDEVでは3.89444、STDEVPでは3.741657となります。
また、平均値7と各数字の差を取り、それを2乗し、総和を取る(182)、これをデータの個数13で割る(14)、この平方根を取ると3.741657となります。
では、STDEVとSTDEVPの違いは何なのでしょうか?統計のことは疎く、お手数ですが、サルにもわかるようご教授頂きたく、お願い致します。

Aベストアンサー

データが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。また母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。
で標本データの時はSTDEVを使って、母集団の時はSTDEVPをつかうことになります。
公式の違いは分母がn-1(STDEV)かn(STDEVP)かの違いしかありません。まぁ感覚的に理解するなら、分母がn-1になるということはそれだけ結果が大きくなるわけで、つまりそれだけのりしろを多くもって推測に当たるというようなことになります。
AとBの違いがあるかないかという推測をする時、通常は標本同士の検証になるわけですので、偏差を余裕をもってわざとちょっと大きめに見るということで、それだけ確証の度合いを上げるというわけです。

Q遠心分離機 スイングローターとアングルローター

遠心分離機にはスイングローターのものとアングルローターのものがあると思うんですが、それらの用途を調べていたら、スイングローターは密度勾配沈殿法に適していて、アングルローターは分画沈殿法に適していると書かれていました。しかし、理由はわかりませんでした。

分かる方回答お願いします。

Aベストアンサー

まず、密度勾配遠心に適する適さないという視点で
スイングローターはある程度回転数が上がると、中に入っている試験管が真横を向きますよね?
試験管の位置は、|の状態から―になり、回転中の重力は→なわけです。
従って試験管の底に向かって、真っ直ぐ力がかかります。
密度勾配による層がきれいに水平になるわけです。
一方、アングルローターは良くて45°の角度で固定です。
試験管の位置が\なのに、回転中の重力は→なわけですね。
これではきれいな層が出来ません。
従って、密度勾配遠心にはスイングローターが適しているわけです。

次に分画沈殿に適する適さないという視点で
上述した通り、スイングローターは試験管真下に力がかかるので、沈殿は試験管の底に落ちます。
アングルローターは、角度がついていますので、真下には落ちません。
底部の壁面にへばりつく形になります。
上清を全て抜き取りたいといった場合(沈殿物が少ないこと前提ですが)、沈殿物が試験管の底にあるより、底部壁面にあった方が抜き取りやすいのです。
やってみないとイメージしにくいかと思うのですが、そうなのです。
そんなわけで、分画沈殿にはアングルローターが適しています。

まず、密度勾配遠心に適する適さないという視点で
スイングローターはある程度回転数が上がると、中に入っている試験管が真横を向きますよね?
試験管の位置は、|の状態から―になり、回転中の重力は→なわけです。
従って試験管の底に向かって、真っ直ぐ力がかかります。
密度勾配による層がきれいに水平になるわけです。
一方、アングルローターは良くて45°の角度で固定です。
試験管の位置が\なのに、回転中の重力は→なわけですね。
これではきれいな層が出来ません。
従って、密度勾配遠心にはスイングロータ...続きを読む

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Q生物系の実験では、遠心分離は何故4度で行うか?

生物系の実験で、冷却遠心分離装置を使う場合、大抵4度で行いますね。あれの根拠が、どこかで詳細に説明されていないでしょうか。
勿論、サンプルをいためない為に「冷やす」という理由はあるのですが、確か水の比重が4度で最も高くなるから(3度とか2度とかまで冷やす事はしない)という説明を聞いた覚えがあります。
...だとすると、水層が上層に来る様な遠心分離の場合は、「水の比重が最も高くなる」温度である4度というのは不利ですよね? この考えが正しいものかどうか知りたいのですが...。

Aベストアンサー

現在の冷却遠心分離器は資料を氷水の中に入れなくとも大丈夫なのでしょうね。

かっては,ん十年前の話ですが,氷水に資料を入れて遠心分離しました。この氷水の温度が実は4℃なのです。

かっては,設定温度を自由に変えることは出来ませんでした。4℃でなくては遠心分離できなかったのです。ですから実験の再現性からほとんど4℃で分離していました。

ほとんど化石の知識ですが,何かの参考になりましたなら。

Q吸光光度法の検量線について

検量線を作成し、データーにばらつきが生じた場合はどのようにすべきなんでしょうか。無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが・・回答をお願いします。

Aベストアンサー

 検量線を引くための標準液は、0を含めて、6点取っています。標準液を調製しやすいように、例えば、0、1、2、3、4、5 mg/mlなど。これを5点検量(0は、普通対照に利用するので)と称しています。4点の場合もあります。
 基本は、グラフを書いて、1点がヅレていたら、それは無視して検量線を引く。2点ズレテイタラ、こりはヒドイので、やり直す、と言うのが教科書です。

 正確にするために検量線を2連(2回)して、その平均を取る、というバカな教えをする教員もいますが(それなら、2連より10連、100連の方が正確、と毒づいています)。
 
 実験のテクニックが難しくて、全体がばらつく場合もあります。この場合は、5点ではなく、10点とか、測定する回数を増やしたりして、信頼性を高めるしかありません。検量線は、もちろんパソコンで引きます。また、サンプルの測定も、一回だけではなく、数回測定して、平均値を去る必要があります。

 化学反応は、バラツキマセン。しかし、生物のサンプルは、個体差があるので、最低3回は測定して、平均と標準偏差を示します。例えば、血糖値を測定するときに、血液中のグルコースの測定は、ばらつかないので1回で十分。しかし、A、B、Cサンそれぞれの値は異なるので、ヒトの血糖値となると、最低3人は測定しなければなりません。
 同じサンプルを測定して、値がばらつくのは単に腕が悪いだけです。学生だと5%程度、慣れると2%以内、分析のプロだと0.5%の誤差でもウルサク言います。
データがばらつく原因を考え、検量線とサンプルの測定回数を決めてください。

>無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが
測定した点をつないだりしているのでしょうか。それはヤリマセン。昔は、測定した点の近くをなるべく通る直線(場合によっては曲線)を、慣れを頼りに引いていました。今ではパソコンがあるので、回帰式を出します。これが検量線になります。最近は、機器に検量線を自動的に描き、濃度まで計算しているのが、普通です。
 回帰式の相関係数が、0.98以上あれば信頼していますが、0.95だとやり直すかどうか迷います。

 検量線を引くための標準液は、0を含めて、6点取っています。標準液を調製しやすいように、例えば、0、1、2、3、4、5 mg/mlなど。これを5点検量(0は、普通対照に利用するので)と称しています。4点の場合もあります。
 基本は、グラフを書いて、1点がヅレていたら、それは無視して検量線を引く。2点ズレテイタラ、こりはヒドイので、やり直す、と言うのが教科書です。

 正確にするために検量線を2連(2回)して、その平均を取る、というバカな教えをする教員もいますが(それなら、2連より10連、10...続きを読む

Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。


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