ゲル濾過について

過去2回同じお題で質問させてもらったものです。屈折率・紫外検出器を用いて、水溶性蛋白質の細分画を行いたいのですが、溶離液には何を使えばよろしいでしょうか？蒸留水ではいけないでしょうか？またその溶離液はどのようにして検出器へ注入すればよろしいでしょうか？ゲルはSephadexG-15を蒸留水で膨張させて、溶出液は蒸留水を使用する予定です。初歩的な質問かもしれませんがどうかよろしくお願いします。

No.4 ベストアンサー 回答者： blackdragon 回答日時： 2004/07/07 21:59

移動層（溶離液）には、通常は、緩衝液（バッファー）を用います。

最もよく用いるのは、リン酸バッファー辺りでしょう。
濃度は、50mMから、200mM程度だと思います。
オートクレーブをするか、真空で脱気したものを用いた方がいいと思います。（ゲル中や検出器のセル内に気泡が生じると厄介なので）

通常は、カラムを通った後の溶離液は、シリコンチューブを通して検出器のIN側に流します。
検出器から出たら、細いチューブを使って、フラクションコレクターに接続するか、最短距離で、手動でピークを分取します。

が、このような説明では書ききれないノウハウが、ゲル濾過の実験には沢山あります。蛋白質の精製に関する専門書を参照されることをおすすめします。

この回答へのお礼

大変参考になりました。リン酸バッファーを使おうと思います。フラクションコレクターは説明書がありませんは、何とか動きそうなやつがあるのでがんばって見ます。ありがとうございました。

お礼日時：2004/07/07 22:36

No.3 回答者： p_nonoko 回答日時： 2004/07/07 21:39

こんにちは。

タンパク質のGPCをかけたことがある者です。
カラムが違うので、溶離液も異なるかもしれませんが、私は東ソ－の親水性用のゲルで硫酸ナトリウム水溶液を用いました。
濃度は確か0.5Mくらいだったと思います。これもまたカラムによって適性が異なるとは思いますが。
水だけだと会合が切れなくて分離が悪いと思いますよ。
一番早いのは、カラムのメーカーに目的物を告げて問い合わせることです。タンパク質なら、たいていのメーカーが経験値を持っていると思うので、そのデータもとに、自分の欲しい条件を探すのが効率がよいと思います。
実験、頑張って下さい。

この回答へのお礼

今のところリン酸バッファーにしようかと思います。研究室にすでにあるので。しかしうまくいかなければ、メーカーさんに問い合わせることもして見ます。ありがとうござしました。

お礼日時：2004/07/07 22:39

No.2 回答者： yuyu2003 回答日時： 2004/07/07 20:45

ただの水だとpHが安定しないので、普通は緩衝液を用いた方がよろしいかと思います。

検出器への導入についてですが、どのようなものを使おうとされているのでしょうか?(フローセルがついているのか、など)フローセルの無い測定器を用いるのであれば、定時(定量)的に溶出液を取って、各フラクションを測定するということになるかと思います。

この回答へのお礼

説明書をよく読んでみると、研究室にある検出器はフローセル付きのものでした。溶離液には、皆さんの意見を参考にさせてもらい、リン酸バッファーを使おうと思います。ありがとうございました。

お礼日時：2004/07/07 22:43

No.1 回答者： c80s3xxx 回答日時： 2004/07/07 16:51

タンパクしだいじゃないですかね．

タンパクによっては蒸留水で変性するようなものだって
あるわけですから．

Sephadex G15 は使ったことがないので確かなことは
いえませんが，ゲルとタンパクの組み合わせによっては
強い吸着がおこることだってあるわけですから．

この回答への補足

それでは変性・吸着が起こらないと仮定すれば、溶離液は蒸留水でよろしいのでしょうか？また注入方法はどのようにすればよろしいのでしょうか？シリンジなどで注入すればよいのでしょうか？何度もすみません・・・。

補足日時：2004/07/07 17:33