制限酵素処理後の保存

プラスミドに挿入したDNAのシークエンスをしようとしています。サイクルシークエンスを行うときプラスミドが環状のままではPCR反応がうまくいきません。そのためあらかじめ制限酵素で線状にしようと考えたのですが、制限酵素処理を行ったあと線状になったプラスミドの長期保存は可能なんでしょうか。長期でなくても一週間ほど保存できればいいのですが。

No.2 ベストアンサー 回答者： notime 回答日時： 2006/08/09 16:52

反応液のまま凍結保存させて大丈夫だと思います。

または精製後にTE buffer に溶解させて凍結で長期保存は可能です。以後の操作に大きな影響は与えないと経験的にですが、言えます。しかし年単位の保存になると多少、DNA の損傷が起きるようです。

この回答への補足

精製後は滅菌水で溶解しても大丈夫でしょうか。サーケンサーにかけたとき滅菌水の方がパターンがはっきりするといわれたのですが。

補足日時：2006/08/09 19:57

No.4 回答者： blackdragon 回答日時： 2006/08/10 00:42

#1です。

シークエンスでセルフライゲーションは無関係ですね。

失敗の原因は、環状だったことだとは考えにくいです。
DNAの純度、量、または、おっしゃるように、反応後の精製のミスなどの可能性が高いです。まずは、それらを検討された方がいいと思います。

長期の保存はTE中が望ましいですが、凍らせて置くなら、滅菌水でもしばらく（数週間）はシーケンス用のテンプレートとしては問題ないでしょう。

No.3 回答者： Epac 回答日時： 2006/08/09 23:19

CIAP処理しないとセルフライゲーションで元の環状に戻ってしまいますよ～。

私も、シーケンシングは環状のままで問題ないと思います。PCRの時のtemplateの濃度やdenature等の条件が悪かっただけじゃないでしょうか？

この回答へのお礼

ご指摘ありがとうございました。前回の時はtemplateが多すぎたかもしれません。濃度計算をしなおして見ようと思います。

お礼日時：2006/08/10 08:27

No.1 回答者： blackdragon 回答日時： 2006/08/09 15:09

-20℃で凍らせておけば余裕で大丈夫ですよ。

でも、そもそも、サイクルシークエンスは普通は環状のままでも問題無いですよ。（特別な事情でもあれば別ですが。）

この回答へのお礼

ありがとうございます。前回失敗した理由はPCR後の精製に問題があると考えています。ですが不安な部分はなるべく取り除いておきたいのでこの操作を行おうと考えています。

お礼日時：2006/08/09 19:57