プラスミドの制限酵素処理

Question

プラスミドを作る時、制限酵素で切断しますよね。切断したサンプルは電気泳動をして、目的のサイズの部分のゲルを切り出して精製して、ライゲーションするわけですが、セルフクローニングがたくさん出てしまい、なかなかうまくいきません。
２種類の酵素で処理（切断部位が近接（数～数十bp））していて、脱リン酸化処理はしていません。２カ所で切断されていれば、脱リン酸化にかかわらず、セルフライゲーションは起こらないはずだと思うので。
だとすると、どちらか一方の酵素でしか切断されていないものが多いことが原因だと思います。１カ所切断と２カ所切断のサイズが同じぐらいであるため、分離するのは難しいと思うのですが、何かよい方法、アドバイスはありませんでしょうか？

xen1234 · Accepted Answer

サブクロしていて一度はみんな経験するトラブルですね。
こんなとき、理屈をいろいろ難しく挙げられる人もいるのですが、
質問者さんも百も承知であると思われるので、
私はこれまで、こういうトラブルを乗り切って
後から考えるとうまくいかなかった理由はこうではないかという
実体験を書かせていただきます。

私の場合、こういうときに脱リン酸化処理が
劇的に問題解決に結びついたことはあまりないいんですよね。

一度、ベクターを２つの制限酵素でカットしてゲル切り出しするときに
面倒だったので、大量のDNAを１レーンに泳動して切り出して、
最後に切り出して抽出したDNAを泳動して確認したときなんですが
ちゃんと切り出したにも関わらず、切れていないベクターと思われる
バンドが確認されたことがあるんです。
このとき、勝手な想像で、
カットされたベクターが多量にありすぎて、
カットされていないベクターを引っ掛けて（巻き込んで）
泳動されたのかなぁと思い、１レーンあたりのDNAを減らすために
１レーンで流した量を10レーンに分けて泳動して回収したところ
１レーンに多量のときとほぼ同じ量が回収でき
かつ、切れ残りと思われるバンドも見えなくなりました。
なんでこうなったか理論はよくわかりませんが、
私の中では迷信かもしれないけど難しい理論より経験が大事だと思った
次第であります。

もし心当たりがおありでしたらお試しあれ。

また、理屈よりもクローンを取ることが大事だと思うので、
どなたかが書かれていましたが、時には力技も必要かもしれません。
私も重要度にもよりますが何度か四の五の言わずにやりました。

geneticist12 · Answer

2つの制限酵素サイト近接している場合（正確には、一方のサイトで切断されたとき、他方のサイトがDNA末端近傍に位置する場合）、片方しか切れにくいということはあります。しかし、pUCのXbaI, SacIでは十分離れているので、この問題ないはずです（これが例えばXbaI, SalIだったりすると、XbaI→SalIだと普通に切れるのに、逆だとXbaIがほとんど切れなくなるなんてことがありますが）。

しかし、

＞どちらか一方の酵素でしか切断されていないものが多いことが原因だと思います。
という可能性も絶対にないとは言い切れません。もしそうであっても、

＞１カ所切断と２カ所切断のサイズが同じぐらいであるため、分離するのは難しいと思うのですが、

おっしゃるとおり、区別することが出来ないので、

＞２カ所で切断されていれば、脱リン酸化にかかわらず、セルフライゲーションは起こらないはずだと思うので。

私はそれでも脱リン酸化をします。たまたま片方しか切れていない分子があってもそれで排除出来ますので。

それと、
＞セルフクローニングがたくさん出てしまい、なかなかうまくいきません。

こういうとき、環状のままで切れ残っているベクターがコンタミしている場合も多いです。これは、ligationなしのコントロールで、多数のコロニーを生じることでわかります。また、こういうときは脱リン酸処理してもあまり改善しないです（脱リン酸酵素が効かなかったといっている場合、本当の原因はほとんどこれ）。原因の一つとして、アルカリ処理でとったプラスミドの中には、不可逆的に部分変性し、二重鎖全体のregistryが狂って、制限酵素が認識サイトを認識できなくなるため、まったく切れなくなったものが多かれ少なかれ含まれることが知られています。

ベクターの切り出しをしているので、対策は講じられているわけですが、環状のままのプラスミドはごく微量のコンタミでも多数のコロニーを生じます（たとえばEtBr染色では絶対に見えないpgオーダーでも、>1000 cpu）。意図したligation反応が効率よく起こっていないときは、たとえコロニーが出ても、こういうのばっかり取れてくることがあります。

根本的には、意図したligetion産物が十分な効率で出来ていないため、バックグラウンドのほうがはるかに数で上回るというところが問題と言えなくもないですが、

tatoo · Answer

トラブルに対していろいろ原因を考えて確認実験をしておられるので私には難しい理論や正論では言うことがありません。
そこで、質問者さんのようなトラブルに見舞われたとき私が考える（信じる）おまじない的なこと（理論無視ではないですけど）を書き込みさせていただきます。

１、制限酵素処理からゲル切り出し、ライゲーションまで、
DNaseのコンタミができるだけないようにって考えながら
bufferなどを変えてみる。
制限酵素処理した後のプラスミドを電気泳動したとき、ちょこっとでもスメアがみえてるような気がしたときはありませか？
そうで無くても、私はなんとなく制限酵素処理中にすこーーしだけでも
DNaseがコンタミしてたらどうなるだろうって考えてしまいます。
せっかくできた制限酵素の切り口がDNaseで平滑になったりするかもとか・・・。電気泳動のときも、ゲル切り出しときもです。
そうだとしたら、制限酵素の切り口だけじゃないだろ？DNaseで切れるのは？ってこともありますが、DNaseによってプラスミドの機能自体がおかしくなったヤツは、それが入った大腸菌は生きられないわけですから・・・。
屁理屈です。ただ、bufferを変えるくらいは簡単ですし、
電気泳動用のbufferやゲルもオートクレーブまではせず
新しく作るくらいで私はやってますので気分転換も兼ねてってことで。

２、コンピテントセルを疑う
市販のやつはまぁ間違いないと思いますが、自作の場合、あり得ないことがおこったり、作った人がやってたりします。
私のところではプラスミドがすでに入った大腸菌でコンピテントセルを作ろうとしてた（ほぼ最後までいっていた・・。）アホがいて、
寸前のところで皆が悩むところでした。まぁ、一応確認ってことで・・。

３、LBプレートを疑う
私は経験ありませんが、抗生物質って熱に弱いとかいう人がいます。
そうでなくてもなんかおかしなことが起こっているかもしれません。
ですが、セルフライゲーションがたくさん出ているという質問者さんのことですので、LBプレートには問題ないと思いますが。

４、大腸菌をまく環境を疑う
他の人のコンタミとかあるかもしれません。私のところでは
消毒用のエタノールが揮発して70％以下になっていたのでしょうか、
その人はそのエタノールに付けた後、火で焼かずに乾燥させたそうで、そうやって菌をまいたところ、取れてきたのは他人のプラスミドだったという、ある意味奇跡が起きたことがあります。
ちょっと確認してもいいかもしれません。

５、セルフライゲーションは仕方がない。
１個でもとれればいいのだから、力技で数多くのクローンを調べる！
これって結構やったことがあります。stratagene社のクイック法などでやるとそこまで苦でなかったりします。

ドツボにはまらないようにお祈りいたします。

tunertune · Answer

＞順番に一つずつ切断してもあまり改善は見られませんでした
それぞれの酵素では切断は確認されたのでしょうか？

geneticist12 · Answer

>切断したサンプルは電気泳動をして、目的のサイズの部分のゲルを切り出して精製して、

これはインサートのことですか？　それともプラスミドベクターも同様に処理しているということでしょうか？

stripe-k · Answer

使用したプラスミドと制限酵素を教えて下さい。

miya_0726 · Answer

１箇所切断と２箇所切断のサイズが同じくらいであるため、と書いてあるところを見ますと、Double digestionされているのでしょうか？

2つの制限酵素で同時に処理する際に、一方の制限酵素の活性が大幅に低くなるようなバッファー組成になっていませんか？どちらかが極端に活性の弱い酵素だったりしませんか？
制限酵素には、切断活性の強いものと弱いものがあります。バッファー組成によってもその活性は変わります。例えばSalIなどは切れにくい酵素の代表でして、相当長い時間をかけないと切れなかったりします。
低塩濃度バッファーで使う酵素と高塩濃度バッファーで使う酵素とを組み合わせたDouble digestionはなかなか難しいです。

ショットガンクローニングに用いるなら、面倒でも１種類ずつ切っては精製を繰り返すほうが確実です。
PCR断片のクローニングなら、Double digestionから強引に脱リン酸化処理するという手もあります。

あと、使っている制限酵素はメチル化の影響は受けていませんか？
メチル化の影響で切断できなくなることは稀ですが、DH5α、DH10B、TOP10、JM109などはdam/dcmメチラーゼがあるので、これらから抽出したプラスミドは特定の塩基がメチル化されています。そのメチル化塩基が制限酵素認識配列にかぶっていたりすると稀に切断できない場合がありえます。ほとんどありませんけど・・・。

プラスミドの制限酵素処理

サブクロしていて一度はみんな経験するトラブルですね。

2つの制限酵素サイト近接している場合（正確には、一方のサイトで切断されたとき、他方のサイトがDNA末端近傍に位置する場合）、片方しか切れにくいということはあります。

トラブルに対していろいろ原因を考えて確認実験をしておられるので私には難しい理論や正論では言うことがありません。

＞順番に一つずつ切断してもあまり改善は見られませんでした

この回答への補足

>切断したサンプルは電気泳動をして、目的のサイズの部分のゲルを切り出して精製して、

この回答への補足

使用したプラスミドと制限酵素を教えて下さい。

この回答への補足

１箇所切断と２箇所切断のサイズが同じくらいであるため、と書いてあるところを見ますと、Double digestionされているのでしょうか？

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