PCR組成とDNAのスメア

PCR後に電気泳動すると、必ずといっていいほどスメアになりました。
トラブルシューティングをすると
スメアがでる原因としては一般的に、
1. DNAポリメラーゼの量が多い
2. 最初の数サイクルの変性時間が短い
3. 変性温度が低い
4. dNTPsが少ない
5. extension時間が長い
6. サイクル数が多い
7. template DNA量が多い
8. Mg++過
9. アニーリング温度が低い
などが考えられるということで
試すと１，４が効果的でした。
でもどうしてdNTPが少ないとスメアになるのか…DNAポリメラーゼの量が多いとスメアになるのか…
が分からないので教えてください！！

No.3 回答者： otx 回答日時： 2008/05/30 20:36

dNTP量が少ない場合

想像してください。
dNTP量が少ないと、DNAが伸びていっているときに、その伸びている場にdNTPがなかなが供給されないと思いませんか？
すると途中で伸長が止まってしまって、結果としていろいろな長さで伸長が止まったDNAが存在することになり、「スメアになる」のではないでしょうか？

DNAポリメラーゼの量が多い場合
想像してください。元々Primerは少し多めに入っています。そのPrimerがアニーリングしているところがあるとして、非特異も若干あるとします。
そんな時に、きっちりとアニーリングしているところが90カ所あるとして、非特異が10カ所あるとします。その時、DNAポリメラーゼの量が90個であった場合、
正しい90カ所＋非特異10カ所＝100カ所の中のどれかに90個のDNAポリメラーゼがある確立で結合して働く訳です。それで、非特異10カ所由来のDNAがある割合で出来ることになります。

それに対して、180個のDNAポリメラーゼを加えたらどうでしょうか？
正しい90カ所＋非特異10カ所＝100カ所すべてのところにDNAポリメラーゼが結合して、必ず非特異10カ所由来のDNAが出来ることになる訳です。

よって多くDNAポリメラーゼを加えると結果として非特異が出来やすくなり、そのサイズはバラバラであると思われるのでスメアになるのではないでしょうか？

dNTP量が少なく、DNAポリメラーゼの量が多い場合
これは上記の２つのことが同時に起こることが予想されるので、更にスメアになるのではないかと。

あくまで、想像です。

No.2 回答者： miod 回答日時： 2008/05/29 22:33

原因は１、４と分かっているのですから、回答の内容が少しずれているように感じます。

ずばり、pol量とdNTP量のバランスが悪いからです。

No.1 回答者： geneticist12 回答日時： 2008/05/28 21:48

ひとことでスメアと言われても、何が起こっているのかわかりません。

目的のバンドが出ていてsmearingしているのか、明確なバンドが無く全体がスメアになっているのか。目的のバンドが見えるなら、スメアはそれより低分子側にひいているのか、高分子側か。スメアといっているけれど本当に連続的なグラディエントなのか、複数のバンドが存在するのか。
どんな鋳型をどれくらい使って、ターゲットサイズはどれくらいか、
それによって関係してくるファクターが対策は違ってきます。
実験系や泳動像を、具体的に描写してください。