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動物細胞にエレクトロポレーションで遺伝子を導入し発現させる実験をしてるのですが、いまいち発現効率が芳しくありません。エレクトロポレーションに対してあまり知識がなく、導入条件も生存率が50%になる電圧・電気容量でやってます。エレクトロポレーションでの遺伝子導入について詳しく書いた文献を御存知の方いらっしゃいませんか?できるだけ、動物細胞について書いたもので、実験によって得られた知見などがたくさん書いてあれば幸いです(贅沢な話ですが)。和文英文問いません。御存知の方がいらっしゃれば、どなたか教えて下さい!

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A 回答 (3件)

エレクトロポーレーションも使っている


バージョン?が変わると効率も全く変わります。
今はBIORADのものを使っているんだけど
教室にあるものと他の教室にあるものでは
同じ電圧、電気容量、細胞数の条件でも
TCの値が2倍違ったので(1.4と0.7)
stableで取れる効率が全く違う
って事があったので系が動いている
ところでしてみるというのが一番いいと思います

あと、エレクトロポーレション以外にも
遺伝子導入方があるので
どんな細胞を使っているかは全く書かれていないので
わかりませんが検討されてみてはどうでしょうか?
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こんにちは。


No1の方のおっしゃるとおり細胞により条件は著しく変わります。お使いの細胞にエレポでtransfectしている論文を検索できれば、materials&methods に詳しい情報があるはずですよ。
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この回答へのお礼

お二人ともご回答ありがとうございます。
今使っている細胞株にエレポレで導入している論文は探してみましたがありませんでした。導入条件(電圧と電気容量)は今の設定で問題ないと思うのですが。。。エレポレって導入条件以外に工夫できるところってあるのでしょうか?

お礼日時:2003/09/26 23:03

こんにちは。


 これは使う細胞によって条件がいろいろのようです。文献にしろ、同じ細胞(株)を使っているのを参考にするべきでしょう。
 使ってるのはGenePulserでしょうか?でしたらBIORADのホームページとかテクニカルサービスで、過去の実験例の報告集みたいのが手に入りますから、あなたの使っている細胞(株)の条件にあったものを探せるかもしれません。
 あとはひたすらトライアンドエラーです。
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また、完全に溶解したかどうかはどうやったら確認できますか?
透明になっていれば溶解したということになるんでしょうが。
沈殿自体が見えにくいのでなかなか苦労しています。

Aベストアンサー

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。

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プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
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このようなプラスミドの収量を上げるには、どうすれば良いでしょうか?具体的な数字で表すと、100μgは取れるといいのですが。
何か工夫すべき点がありましたら、ご教授願います。

Aベストアンサー

まず、プラスミドの骨格は何でしょうか。
low-copyかどうかは普通は疑うのではなく調べるものです。
プラスミドのoriが何由来なのかを調べれば大体のコピー数と収量がわかります。
http://www.promega.co.jp/cat/technical/17-q.html
P1 phage由来のPACベクターに大きいインサートが入っていれば1l培養しても10ugしか取れないということはあります。

それと、1mlで培養した時にはどのくらい取れるのでしょうか。
たいてい少量のスケールで精製したもののほうがml当たりの収量はいいです。
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まず、プラスミドの骨格は何でしょうか。
low-copyかどうかは普通は疑うのではなく調べるものです。
プラスミドのoriが何由来なのかを調べれば大体のコピー数と収量がわかります。
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P1 phage由来のPACベクターに大きいインサートが入っていれば1l培養しても10ugしか取れないということはあります。

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Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

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形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

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Qプラスミド精製の原理

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簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

Q大腸菌のグリセロールストック

大腸菌のグリセロールストックについての質問なのですが、グリセロールの濃度はどのくらいがよいのでしょうか?

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私の研究室では、30%(v/v)を用いています。
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混和後は、可能なら液体窒素で瞬間凍結したほうが望ましいのかもしれません。私は、瞬間凍結しなかったことがないので、しない場合のことはわかりません。
量的には少量でいいですが、大事なクローンであれば、3つくらい作って、普段使う用と保存用を別のストッカーに入れると安心です。


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