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操作でわからないことがあります。ご教授願います。
スペクトル測定についてです。
スペクトルマネージャーを起動するとたいてい600nmでAbsが0.7~0.8あたりの値を示しています。
測定の順序として、
1.空気をブランクにセルを入れないでオートゼロ
2.セルにサンプルと同じ溶媒を入れて全領域においてベースライン測定
3.その後セルにサンプルを入れて測定
このような流れで問題はないでしょうか?

そしてもう一つ疑問なのが対照セルを使わなければならない実験と使わなくても良い実験の区別が
つかないのでそれについても併せて教えていただきたいです。

拙い文章で伝わりきらない点があるかもしれませんが、宜しくお願いします。

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A 回答 (1件)

箇条書きのようになりますが、ご質問の流れに沿って、いくつか記します。



600nm での吸光度が 0.7~0.8 ということは、黄色あたりの光が7~8割カットされてきている、ということになります。サンプル(溶液)に青みがかかっているならともかく、そうでなければ光源から鏡で反射して検出器までいる経路になにか邪魔なものが居座っていないか、確認されたほうがよいでしょう。(光源、サンプル側、ブランク側、検出側、どれでも起こりえます)

溶媒だけのときのベースライン測定が必要ということは、測定する波長の範囲で、溶媒が特定の波長の光を吸収してしまう、ということの裏返しです。その場合、サンプルのせいなのか区別つかなくなるので、ベースライン測定をして比較するか、対照セルとして同じ溶媒を入れたセルをおいて一気に差を測定させてしまう、という方法をとります。

ベースラインを測定するより、対照セルとしてサンプル側と同じ仕様のセルが準備できるなら、対照セルと同時に測定してしまったほうが実験結果としても明瞭にはなります。そして、いっぺん「対照セル」だけをサンプル側として測定しておけば、装置になにか変化が起きてないか、従来と同じ機能を発揮しているか、の確認やメンテナンスにもなります。
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Q分光光度計での測定手順

分光光度計である溶液の濃度を測定しています。
人によって二つのやり方があることが分かり、どちらが正しいかを検討しています。
ちなみにダブルビームです。
(方法1)
・キュベットAとBに水を入れてゼロ補正
・次にキュベットAにブランク、キュベットBにサンプルを入れて吸光度の差を測定する。
(方法2)
・キュベットAに水、キュベットBにブランクを入れてゼロ補正
・次にキュベットAに水、キュベットBにサンプルを入れて測定。
・ブランクとサンプルのそれぞれの吸光度の差を計算する。

どちらでも良いという人と、差があるようだという人と分かれています。どなたか教えてください。

Aベストアンサー

以前、分光光度計の設計をやっていました(早い話、作る方のプロでした)。

操作上のミスや誤差を抜きにして言えば、装置的には優位な誤差に違いは
ないように思いますが、分光光度計の設計者が想定している使用方法は、
きっと(方法1)ですね(ひょっとして私だけだったらごめんなさい)。

関係しそうなポイントをいくつか挙げておきます。

1.ゼロ補正は、再現可能性の高いものを基準として実施した方が良い。
  つまり、今日も明日も明後日も、特別なアクセサリを使用せず、
  いつものキュベットで普通の水溶液で吸光度測定をする限り(有機溶媒
  系で測定とかでなく)、試料Aを測定するにも試料Bを測定するにも、
  いつも0Absの基準は同じものにするのが望ましいです。そのためには、
  "常に同じ"蒸留水同士で取るのがベターと考えます。

2.ダブルビームの分光光度計は基本的に、サンプル溶液とブランク溶液
  の比をリアルタイムで測定することを前提に設計しています。
  (きっとどのメーカーも)

ただし、これは作る側の立場で考えていることなので、使う側の方が
「こちらの方が理屈でも経験上でも良い結果が出る」ということであれば、
決してそれを否定するものではありません。
特に、分光光度計の設計者の多くは物理屋であり、使う方々の多くはきっと
化学屋さんである点は要注意かも知れません。

以前、分光光度計の設計をやっていました(早い話、作る方のプロでした)。

操作上のミスや誤差を抜きにして言えば、装置的には優位な誤差に違いは
ないように思いますが、分光光度計の設計者が想定している使用方法は、
きっと(方法1)ですね(ひょっとして私だけだったらごめんなさい)。

関係しそうなポイントをいくつか挙げておきます。

1.ゼロ補正は、再現可能性の高いものを基準として実施した方が良い。
  つまり、今日も明日も明後日も、特別なアクセサリを使用せず、
  いつものキ...続きを読む

Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

Qブランク値って・・・

吸光光度法のブランク値ってなんですか?

Aベストアンサー

ブランク(blank)=空白。
測定したい溶質を含まない溶媒だけを分光光度計のセルに入れて測定し、
検量線のゼロ点にあたる値を測ります。これがブランク値です。
これにより、妨害物質や使用セルの光路長に由来する誤差の影響を
排除することができます。

Q吸光光度法の検量線について

検量線を作成し、データーにばらつきが生じた場合はどのようにすべきなんでしょうか。無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが・・回答をお願いします。

Aベストアンサー

 検量線を引くための標準液は、0を含めて、6点取っています。標準液を調製しやすいように、例えば、0、1、2、3、4、5 mg/mlなど。これを5点検量(0は、普通対照に利用するので)と称しています。4点の場合もあります。
 基本は、グラフを書いて、1点がヅレていたら、それは無視して検量線を引く。2点ズレテイタラ、こりはヒドイので、やり直す、と言うのが教科書です。

 正確にするために検量線を2連(2回)して、その平均を取る、というバカな教えをする教員もいますが(それなら、2連より10連、100連の方が正確、と毒づいています)。
 
 実験のテクニックが難しくて、全体がばらつく場合もあります。この場合は、5点ではなく、10点とか、測定する回数を増やしたりして、信頼性を高めるしかありません。検量線は、もちろんパソコンで引きます。また、サンプルの測定も、一回だけではなく、数回測定して、平均値を去る必要があります。

 化学反応は、バラツキマセン。しかし、生物のサンプルは、個体差があるので、最低3回は測定して、平均と標準偏差を示します。例えば、血糖値を測定するときに、血液中のグルコースの測定は、ばらつかないので1回で十分。しかし、A、B、Cサンそれぞれの値は異なるので、ヒトの血糖値となると、最低3人は測定しなければなりません。
 同じサンプルを測定して、値がばらつくのは単に腕が悪いだけです。学生だと5%程度、慣れると2%以内、分析のプロだと0.5%の誤差でもウルサク言います。
データがばらつく原因を考え、検量線とサンプルの測定回数を決めてください。

>無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが
測定した点をつないだりしているのでしょうか。それはヤリマセン。昔は、測定した点の近くをなるべく通る直線(場合によっては曲線)を、慣れを頼りに引いていました。今ではパソコンがあるので、回帰式を出します。これが検量線になります。最近は、機器に検量線を自動的に描き、濃度まで計算しているのが、普通です。
 回帰式の相関係数が、0.98以上あれば信頼していますが、0.95だとやり直すかどうか迷います。

 検量線を引くための標準液は、0を含めて、6点取っています。標準液を調製しやすいように、例えば、0、1、2、3、4、5 mg/mlなど。これを5点検量(0は、普通対照に利用するので)と称しています。4点の場合もあります。
 基本は、グラフを書いて、1点がヅレていたら、それは無視して検量線を引く。2点ズレテイタラ、こりはヒドイので、やり直す、と言うのが教科書です。

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Q吸光度計にて 石英セルとガラスセル

抽出したゲノムDNAの濃度測定にて、吸光度計を使用して吸光度を調べる実験を最近行いました。そのとき抽出して希釈したDNAを石英セルに入れたのですが、そこで先生から
「石英セル以外にガラスセルやプラスチックセルもあるのになんで石英セルを使うの?」
という質問をされ、
「屈折率の問題で石英セルが一番適しているからです。」
と答えたのですが、
「それはプラスチックだけ。なんの不純物も入ってないガラスセルなら屈折率なんて問題にならないよね?じゃあそれ以外で石英セルのほうがいい理由は?」
と言われ、そこでまったく答えらませんでした。調べたところ、ガラスより石英のほうが高価だから精密度がいい?といったものが出たのですが・・・違うようです。
なぜ、ここでは石英セルを使用するのですか?教えてください。お願いします。

Aベストアンサー

 学生時代に酵素の精製をしていて、「ゼロ合わせができません」と先生に言って大恥をかいた記憶があります。酵素ですから、測定波長は280nmです。40年も前のことですから、プラスチックセルはありません。研究上での恥のかき始めなので、今でも鮮明に覚えています。
 セルを超音波洗浄器で洗って、バラバラにしたこともあります。セルは、私にとっては、実験の最初の失敗。以後、失敗は数知れずですが、・・・。

>じゃあそれ以外で石英セルのほうがいい理由は?
正解は、「石英セルのほうがいいではなく、石英セルでないと・・・」です。
 http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/sel01.html
 石英セルは、可視部も紫外部も通します。ガラスセルでは、可視部は通すが、紫外部はほとんど通さないようです。ですから、石英セルで可視部を測るのは測定上は適正なのですが、破損の可能性を考えて(石英セルは1個1万円、ガラスセルは3000円ほどでした)、可視部はガラスセル使用というのが現実的です。
 当時は、石英セルには、セルの上部にスリガラスの線が入っているものが石英セルでした。今は違うようですが。

 「セルが壊れました」と実習学生が持ってきてくれると、『福沢諭吉がヒラヒラと飛んでいく』ことになります。貧乏な研究室の教員としては『実習をまじめにしなければ壊れることも無い』と思いつつも、顔は引きつりかけます。学生実習は、結果が分かりきっているので、当然プラスチックでしています。しかし、紫外部の測定に適したプラスチックセルは無いようで、「測定可」とした製品も文字のとおり可の状態で、石英セルのレベルではないとの業者の回答でした。

 セルで思い出すのは、吸光度を測定する2面透明のセルで蛍光を測定しているのを見ました。他の研究生の卒論生だったので、「測定するのは難しいのと違う」と声をかけましたが、その後どうしたことやら。

参考URL:http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/sel01.html

 学生時代に酵素の精製をしていて、「ゼロ合わせができません」と先生に言って大恥をかいた記憶があります。酵素ですから、測定波長は280nmです。40年も前のことですから、プラスチックセルはありません。研究上での恥のかき始めなので、今でも鮮明に覚えています。
 セルを超音波洗浄器で洗って、バラバラにしたこともあります。セルは、私にとっては、実験の最初の失敗。以後、失敗は数知れずですが、・・・。

>じゃあそれ以外で石英セルのほうがいい理由は?
正解は、「石英セルのほうがいいではなく...続きを読む

Q分光光度計でダブルビームで測定する理由

分光光度計でダブルビームで測定する理由は何なのでしょうか。

以前、日本分光社製の紫外可視分光光度計(ダブルビーム)を使用していました。
例えば、色素のクロロホルム溶液の吸光度を測定する手順は
(1)まず、参照セルとサンプルセルにそれぞれクロロホルムを入れてベースライン測定をします。
(2)次に、サンプルセルの中身を色素のクロロホルム溶液に換えてサンプル測定をする
という流れでした。

しかし、初めから参照セルが空、(というよりセルすら無し)で、サンプルセルのみで(1)ベースライン測定、(2)サンプル測定を行っても同じスペクトルが得られました。

日本分光のHPを見ると、
http://www.jasco.co.jp/jpn/technique/internet-seminar/uv/uv5.html
ダブルビームだと経時での光源のふらつきを補正できるらしいのですが、、、

結局は(2)のサンプル測定で記録したスペクトルから(1)のベースライン測定で記録したスペクトルを差し引いているのですよね?
そうしますと、結局は経時で光源の光量は変化しますので(1)のベースライン測定から時間がたてばたつほど(2)のサンプル測定時の吸光度は正しい値からずれるので、ダブルビームでもシングルビームも同じだと思うのですが。
それとも、(2)のサンプル測定時に、(1)のベースラインを差し引いた上でさらに、参照セル側との差を補正しているのでしょうか。そうすると、上で述べました参照セル無しの場合でも、有りの場合と同じスペクトルが得られるはずは無いのですが。

詳しい方いらっしゃいましたら、教えて下さい。

分光光度計でダブルビームで測定する理由は何なのでしょうか。

以前、日本分光社製の紫外可視分光光度計(ダブルビーム)を使用していました。
例えば、色素のクロロホルム溶液の吸光度を測定する手順は
(1)まず、参照セルとサンプルセルにそれぞれクロロホルムを入れてベースライン測定をします。
(2)次に、サンプルセルの中身を色素のクロロホルム溶液に換えてサンプル測定をする
という流れでした。

しかし、初めから参照セルが空、(というよりセルすら無し)で、サンプルセルのみで(1)ベースライン測定、(2)サ...続きを読む

Aベストアンサー

ダブルビーム方式では、参照セル側の検出器で常に光源の光量をモニタしながら測定している、と考えるといいです。

I_sam_2 = サンプル測定時に試料セル側の検出器に入ってきた光の強さ
I0_sam_2 = サンプル測定時に試料セルに照射された光の強さ

とすれば、試料セルの透過率は定義により

(式1) 試料セルの透過率=I_sam_2/I0_sam_2

となります。しかし、これではセルそのものや溶媒の透過率を一緒に測っていることになりますので、通常はサンプル測定に先立ち、ベースライン測定を行います。

I_sam_1 = ベースライン測定時に試料セル側の検出器に入ってきた光の強さ
I0_sam_1 = ベースライン測定時に試料セルに照射された光の強さ

とすれば、試料の透過率は

(式2)  試料の透過率=(I_sam_2/I0_sam_2)/(I_sam_1/I0_sam_1)=(I_sam_2/I_sam_1)/(I0_sam_2/I0_sam_1)

となります。I_sam_2とI_sam_1は検出器の出力から分かります。I0_sam_2/I0_sam_1をどう評価するかが、シングルビーム方式とダブルビーム方式で大きく異なる点です。

シングルビーム方式では、I0のドリフトが小さいものと仮定し、I0_sam_2=I0_sam_1として試料の透過率を求めます。

(式3)  シングルビーム方式の透過率=I_sam_2/I_sam_1

つまり、ベースライン測定時とサンプル測定時で、I0が変わらないものとして透過率を算出しています。

一方、ダブルビーム方式では、参照セルを用意して、参照セル側の検出器でI0のドリフトをモニタします。

I_ref_2 = サンプル測定時に参照セル側の検出器に入ってきた光の強さ
I_ref_1 = ベースライン測定時に参照セル側の検出器に入ってきた光の強さ

ここで、I0_sam_2/I0_sam_1=I_ref_2/I_ref_1と仮定すれば、試料の透過率は

(式4)  ダブルビーム方式の透過率=(I_sam_2/I_sam_1)/(I_ref_2/I_ref_1)

となります。仮に入射光I0がドリフトしてI0_sam_2>I0_sam_1となったとしたら、透過光強度I_sam_2が大きく測定されます。しかしビームスプリッターで分けられた参照セル側のI0も同時に大きくなるので、透過光強度I_ref_2も大きくなり、比をとることで相殺されます。これがダブルビーム方式のドリフト補正のしくみです。

> 初めから参照セルが空、(というよりセルすら無し)で、サンプルセルのみで(1)ベースライン測定、(2)サンプル測定を行っても同じスペクトルが得られました。

I_ref_2とI_ref_1の絶対値は参照セルの有り無しで大きく変わりますが、I_ref_2/I_ref_1は参照セルの有り無しでほとんど変わりません。ですので、参照セル無しの場合でも、有りの場合と同じスペクトルが得られます。

ダブルビーム方式では、参照セル側の検出器で常に光源の光量をモニタしながら測定している、と考えるといいです。

I_sam_2 = サンプル測定時に試料セル側の検出器に入ってきた光の強さ
I0_sam_2 = サンプル測定時に試料セルに照射された光の強さ

とすれば、試料セルの透過率は定義により

(式1) 試料セルの透過率=I_sam_2/I0_sam_2

となります。しかし、これではセルそのものや溶媒の透過率を一緒に測っていることになりますので、通常はサンプル測定に先立ち、ベースライン測定を行います。

I_sam_1 = ベー...続きを読む

Q分光光度計・吸光度とは?

ある液体の濃度測定をお願いしたところ、「分光光度計にて595nmにおける吸光度を測定する」と言われました。僕にはさっぱり意味が分からず、結果の数値を見ても人に説明できません。で、分光光度計とは?吸光度とは何でしょうか?何を測定したのでしょうか?まったくの無知なもので、よろしくお願いします。

Aベストアンサー

 分光光度計とは、光源から出た光を波長ごとに分ける部分(分光部)と、分けた光を試料に当てて光の弱くなる程度を測定する部分(光度計)からなります。
 試料に当てる光の強さをXとし、試料を通過した後の光の強さをYとすると、
 まず、透過率を求めます。透過率・・・T(%)=X/Y×100
 もっとも、普通に光度計で則って居する場合、純水などをいれた空セルで100%合わせをして、次にセル内を試料に入れ替えて測定するので、透過率は装置に表示され、計算する必要はありません。
 次に、この透過率から吸光度を求めます。
 吸光度=-log(T/100)
 なぜ吸光度を計算するかと言うと、溶液中の光を吸収する成分の濃度が吸光度と比例するからです。
 予め濃度の分かった標準試料を用いて、濃度と吸光度の関係を求めて「検量線」を作っておき、その他試料の吸光度を測定する事で濃度が求められます。

 測定する色調により波長は変わります。
 検量線作成に先立って、標準試料の場合の吸収スペクトル(広い波長範囲にわたり、波長と光の吸収度の関係をグラフ化したもの)を採り、測定上最適な波長を決めます。
 普通は、光の吸収の一番大きい波長を選びますが、その他条件も加味して決定する必要は有ります。
 595nmは可視光線のやや長目の波長です。

 なお、#2さんの提示されている「Lanbert-Beerの法則」(ランバート・ベールのほうそく)は基本的かつ重要で有名な法則です。

 P.S 吸光度の計算例
 透過率=85.3%だとすると、
 吸光度=-log(85.3/100)=0.069
 (昨今の分光光度計は吸光度も自動表示されるので、いちいち計算する必要は無いのですが、原理を知っている事は大切です)
 
 

 分光光度計とは、光源から出た光を波長ごとに分ける部分(分光部)と、分けた光を試料に当てて光の弱くなる程度を測定する部分(光度計)からなります。
 試料に当てる光の強さをXとし、試料を通過した後の光の強さをYとすると、
 まず、透過率を求めます。透過率・・・T(%)=X/Y×100
 もっとも、普通に光度計で則って居する場合、純水などをいれた空セルで100%合わせをして、次にセル内を試料に入れ替えて測定するので、透過率は装置に表示され、計算する必要はありません。
 次に、この...続きを読む

Q吸光度と透過率

 早速質問させていただきたいのですが、吸光度と透過率にはどのような関係があるのでしょうか?ランベルトベールの法則を利用すると言うのはわかるのですが、吸光度は透過度の逆対数であると理解しているのですが、どう関係しているか分かりません。教えてください。

Aベストアンサー

私も時々分らなくなることがあります。苦手のひとつですね。分光計で考える良いと思います。試料溶液と溶媒単独を同じ光源からのそれぞれ通過させ、溶媒単独と通過してきた光の強さ(光電管の電圧)I0 と試料溶液を通過してきた光の強さ(光電管の電圧)Iとして、縦軸に光学密度(吸光度とも称されます)log(I0/I)又は透過率(I/I0)、横軸に波長又は波数のチャートが得られます。それ故、吸光度は透過率の逆数の対数になりますね!

Q原子吸光光度計のオートゼロについて

私は現在、環境中の重金属の濃度を分析する研究を行っております。

重金属の測定にはフレーム/フレームレス原子吸光光度計を使用しております。
私は試料の測定を行う直前に、オートゼロのボタンを押して、レファレンスの信号を0にすることにしています(他の方も当然そうしていると思います)。

しかし長時間試料を測定していると、レファレンスの信号が0から外れてくることがあります。この場合、試料測定中にオートゼロを再び押しても良いのでしょうか?

測定中に分析操作の条件を変更することは控えるべきだと理解はしていますが、測定中のオートゼロが、条件の変更に該当するのかどうか分かりません。

この件に詳しい方がいらっしゃいましたら、お手数ですが回答をお願いいたします。

Aベストアンサー

ベースラインがずれる理由による.
計測系は一般にドリフトといってだんだん全体の信号の位置が変化していくということがおこる.
これは光学系や電気系の安定性の問題だが,そういう問題でおこるゼロレベルの変化は,オートゼロでもなんでも好きにすればよい.
しかし,たとえば何サンプルも測っていると,すこしずつコンタミが蓄積してバックグラウンドになるとか,あるいは,以前のコンタミがだんだん取れてくるとかでゼロレベルが変化するとかいうこともありうる.こういうときは,オートゼロ以前に分析値自体に信頼性がおけなくなる.

Qメスピペットの目盛りについて

メスピペットの目盛りがいまいち分かりません。
先端目盛りと中間目盛りの違いと目盛りの見方を教えてい下さい。
実験が始まる前までに何とか解決したいので、宜しくお願いします。

Aベストアンサー

中間目盛り:一番上の目盛りまで吸い上げ、そこから出して所定の目盛りまで出すとその量が排出されるタイプ
先端目盛り:ある目盛り量を取って、すべて出し切るとその目盛り分排出されるタイプ
うまく説明できませんがわかりましたか?


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