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「蛍光」の方で、励起光で、励起状態にした後の蛍光強度の測定というのは、分光光度計で同じ波長のODを測るのと同じ理屈でしょうか?
質問が、的を得ないですみません。
例えば、ある蛍光試薬の、蛍光波長が547nmだとして、励起
後の蛍光強度は、分光光度計で測定したODと同じはずなんでしょうか?
質問の内容が不明な部分は、補足いただくと助かります。
どうぞよろしくお願いします。

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A 回答 (4件)

原理は知らなくても、使えれば良い、と思っていますので。

その立場から回答します。ご質問の意図とズレテいればご容赦を

>「蛍光」の方で、励起光で、励起状態にした後の蛍光強度の測定というのは、分光光度計で同じ波長のODを測るのと同じ理屈でしょうか?
 全く違います。原理から言えば、分光光度計は吸光分析、蛍光は発光分析です。

 分光光度計のセルは、二面だけが透明です。一方から入ってきた光を基準としてに、セルの中でどれだけ吸収されたか、それをセルから出てきた光の量との比で表します。比ですから、特定波長(普通は、極大吸収波長)では、どの分光光度計で測定しようと同じになります(pHなどの些細な条件を無視すれば)。また、誰が測ろうと同じ値になるハズなので、1モルの濃度の吸光度は、モル吸光係数として表すことができます。吸光度は、絶対的な値と考えることができます。
 蛍光の場合は、4面透明のセルですね。30年も前に、「1個1万円(私の1ヶ月の生活費)」と聞いてビビッタことがあります。これは、一方から入ってきた光がセル内の蛍光物質に当たり、そこで蛍光を発します。これを入ってきた光が妨害しない90度の角度から測定します(ですから4面透明)。したがって、入ってくる光が強ければ強いほど、蛍光波長での値は大きくなります。すなわち、使う機械、温度などによって大きく左右されます。また、機械的に感度をあげて見かけ上の値を大きくすることも可能です。すなわち、相対的な値なのです。そこで、標準物質をもちいて、その相対的な値として表します。

 溶液Aがある場合、吸光度は、どこで、どの機械で、誰が測ろうとも同じ値になります。モル吸光係数さえ分かれば、検量線を描かなくても、計算できます。
 蛍光強度では、同じひとが同じ機械で測ろうと、同じ値には必ずしもなりません。ですから、毎回標準物質を用い、その相対的な値として表します。

 なお、蛍光強度は、吸光どの1000倍程度の感度がある、と言われています。蛍光を用いるのは、感度が良いので、微量でも測れるからです。
 
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
非常によくわかりました。
また、質問することがあると思いますので
その時はよろしくお願いします。

お礼日時:2005/03/16 20:34

>同じ値が


濃度ですか。私が使っていた頃は光の強度しか測定する機会がなく.I/I0とかcpsだった頃です。

トレースアビリティ(と音で覚えているので表記は下記サイト三章)の話しでよいですか。
物を測定する場合方法はいくつもあります。しかし.ある方法を使った場合と.別の機械で測った場合で.内容が異なるということは大きな問題となります。
簡単な例としては.百貨店とかファンシーショップに売られているマンガの絵入の湿度計とか温度計。もし.同じ場所に置いてあるのであれば.全部同じ値を示す必要があります。ところが.結構バラけるのです。ここが問題なのです。どの機械でいつ測っても.使用公差(誤差)の範囲内で一致しなければ.どれを信じて良いのかわからなくなるのですから。
そこで.どの方法で計っても同じ結果になるように.測定機器の管理が行われるようになりました。これがトレースアビリティです。
具体的には.つくばの計量研とかきでんけんで行っているのですが.誤差の範囲内で必ず一致するように機会(けいりょうき)の管理をするようになっています。

http://www.nmij.jp/chishiki/trace.html
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この回答へのお礼

お礼が遅くなって申し訳ございません。
再度の回答ありがとうございました。
また、よろしくお願いします。

お礼日時:2005/03/31 17:19

「OD」Optical Density(濃度)約しちゃうと専門家は「?」かも。


「すぐに解答ほしいです」なので、他にもっと分かった方の解答が出てくるまで待っていましたが、今のところ「専門家」の回答が無い様なので、「準専門家」から一言。
ご存知の様に分子を可視、紫外領域で励起しますと、#1のお答えにもあるように、有機物ではn→π*遷移、π→π*遷移が多く起こり、遷移金属ではもっぱらd→d遷移が起こります。
基底状態と励起状態のスピン多重度が「同一」の場合「許容」で多重度が変わる遷移は「禁制」ですよね。n→π*の吸収強度が小さいのも軌道の対称性で本来は「禁制」だからだということもご存知でしょう。
同様に蛍光発光でも同一多重度の基底状態へ「落下」(「励起」の対義語が分から無い。汗)します。
励起でも多くの場合基底状態の最低分子振動回転状態から同じ多重度の励起状態の最低分子振動回転状態とは各種の対称性から「禁制」遷移となるため、励起状態のそれも振動励起された構造への遷移となるため、吸収に「振動構造」が見られることもご存知だと思います。
つまりその分「余分」なエネルギーが必要なわけで、短波長側に分散されています。「落下」の場合も全く同じことが言え、落下してくる先は基底状態の振動励起状態になるため、今度は振動構造が長波長側に現れます。吸光と発光(この場合蛍光)のスペクトルが丁度「吸収の最長波長ピーク」と「蛍光の最短波長ピーク」の間のある波長を中心に「線対称」に見えることは良く知られています。(内容的にはただの見かけですが)分子量が大きくなると振動励起状態の数が増え吸収も発光も振動構造がきれいに見えなくなってしまいます。
さて、このような原理で発光(蛍光)が生ずるのですが、励起状態が基底状態に戻る場合「落下」して蛍光を生ずる場合ばかりではありません。特定の分子ではスピン多重度が違う状態へ振動回転構造の寄与によってかなりの量が「系間交差」し半減期の長い「燐光」を発してゆっくりと基底状態へ戻ります。「三重項増感剤」と呼ばれる分子の系間交差効率は非常に高くなります。また励起状態は「格子緩和」つまり基底状態の振動回転状態と交差して「熱的」に基底状態に戻ることも可能です。さらに場合によっては特定の結合が解離したり電子を失って「反応」を起こしてしまう場合もあります。
つまり励起された分子のすべてが「蛍光・発光」をするわけではないので、「蛍光の量子収率」は必ず1より小さな値になります。もちろん分解して全く別の物質になりその物質が「蛍光」を大きな強度で出すため量子収率が1を超える事もありますが、今回のご質問からは離れてしまいます。
ただし以下の事は言えます。安定な励起状態を持つ分子からの蛍光収率は一定です。つまり同波長、同強度の光を照射して得られる蛍光強度は溶質の濃度に比例します。ただし、吸収が強すぎてセルの中での受光強度が異なる様になると吸収も飽和し、発光も飽和します。
測定法は通常照射光と直交する面からの発光を測定していますが、照射しながらその散乱光も含んだ形での測定と、照射光を遮断したあとの減衰を見る方法と色々な装置が開発されています。特にフェムト秒まで計れる様になったので面白い研究や応用があり多くは既に実用化されています。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
わかる部分と、わからない部分があり、もう少しじっくり
頂いた回答を読み、自分でも勉強して、再度質問してみたいと思います。

お礼日時:2005/03/16 12:35

>るのと同じ理屈でしょうか?


「何の理屈」でしょうか補足ください。
雰囲気から.急行と醗酵のきこうでも説明すればよいかなと思い下のとおりに書きますが

>同じはずなんでしょうか?
{OD}が何の略語がわからないのですが。

有機物の蛍光は.nπかぱいぱい遷移でレイキしたときに.発する光を測定します。
分光光度法では.きゅうこうを測定しますので.レイキに要する光を測定する場合と.それ以外の光を測定している場合があります。

問題が.起動の不連続性です。変な起動(構造がゆがっだりしている場合)があったりする場合があります。熱となって逃げたりしますので.きゅうこうしたエネルギーとはっこうのエネルギーはおな時になりません(熱で起動が変化するために.へんなえ練るぎー順位のきどうがあるばあいがある)。

この回答への補足

回答ありがとうございます。
ます「OD」ですが、optical density のつもりで書きました。
失礼しました。

>「理屈」
 実際、作業的には無理だと思うのですが、励起後の蛍光強度を、分光光度計で測っても、蛍光分光光度計で測ったのと同じ値がでるんだろうか?と思って質問してみました。

補足日時:2005/03/16 12:31
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Q蛍光スペクトル

蛍光スペクトルと励起スペクトルについて教えてください

励起光の波長を変化させて蛍光の波長を固定して測定したものが励起スペクトルで、励起光を固定して蛍光の波長を測定したものが蛍光スペクトルだというのはわかるのですが、2つがどういうものかということがよくわかりません。

教科書のスペクトルと見ると、横軸は波数で蛍光の波長だと、わかるのですが、励起光の波長はどこに表されているのでしょうか?

またどうして励起スペクトルと蛍光スペクトルが鏡像関係にあるのかもわかりません。

あまり難しい言葉や数式は使わずわかりやすく回答してもらえれば幸いです。

Aベストアンサー

#1さんの説明の通りですが、いくらか、図などがあった方がわかりやすいかもしれませんので、参考URLにgoogleで出て来たページを紹介します。ページ中程にあるJablonski Diagramの左側が蛍光について示した物です。以下、おそらく溶液の蛍光についての質問であると予想して、述べます。

さて、蛍光の過程について述べますと、蛍光とは図にある青の矢印に対応する励起光を分子が吸収します。その後、図では黒色の矢印で示された光を発しない緩和過程(溶媒などに熱エネルギー等の形でエネルギーを渡し、エネルギーの低い状態へ移動する)を経て励起状態振動基底状態へ移動します。そして、図では緑の矢印で示されている蛍光が発光します。

質問者様のおっしゃる励起スペクトルはこの青色の矢印の波長を変えながら緑色の矢印すべてひっくるめた蛍光全体の強度を測ります。このとき、電子励起状態の振動基底状態や振動励起状態(図では太い横線が各電子状態の振動基底状態を示し、その上の細い横線がその電子状態の振動励起状態を示しています。)へ励起されますので、励起光の波長は電子励起状態の各振動状態のエネルギーに対応したものとなります。溶液などでは、振動励起状態へ励起してもすぐにその電子状態の振動基底状態へ緩和されますので、緑の矢印全体の強度というのは、励起された分子の数に比例します。つまり、励起スペクトルは分子の吸収スペクトルに比例したようなスペクトルが得られるわけです。(もちろん、いろいろ例外はありますが)

さて一方、質問者様のおっしゃる蛍光スペクトルは緑色の矢印をさらに分光器などで分散させて矢印一本一本を別々の波長として観測するスペクトルです。つまり、波長は電子励起状態の振動基底状態から電子基底状態の振動励起状態のエネルギーに対応したものとなります。

蛍光スペクトルにおいて、励起光の波長がわからないと言うことですが、溶液などでは励起分子はすぐに電子励起振動基底状態へ緩和しますので、励起光の波長を変えて励起する分子の振動状態を変えても、蛍光スペクトルはすべて電子励起振動基底状態からのもので、波長とその強度比は変わりません(励起スペクトルのように全体の強度はかわりますが)。このような場合、励起光の波長を書かないことが多いです。

図でもわかるように、励起光の波長と蛍光発光の波長はは電子励起振動基底状態のエネルギーをはさんで、励起光は電子励起状態の振動エネルギーだけ高いエネルギー(短い波長)になり蛍光は電子基底状態の振動エネルギーだけ引いエネルギー(長い波長)になり、それぞれの振動エネルギー構造が似ていれば、鏡像のような形になることがわかります。

以上、「励起光が書いていない」ということから類推して、すべて溶液の蛍光測定と仮定してお答えしました。気体や分子線を使ったLIFではちょっと話がかわってきますので、その点はご留意ください。

参考URL:http://www.jp.jobinyvon.horiba.com/product_j/spex/principle/index.htm#01

#1さんの説明の通りですが、いくらか、図などがあった方がわかりやすいかもしれませんので、参考URLにgoogleで出て来たページを紹介します。ページ中程にあるJablonski Diagramの左側が蛍光について示した物です。以下、おそらく溶液の蛍光についての質問であると予想して、述べます。

さて、蛍光の過程について述べますと、蛍光とは図にある青の矢印に対応する励起光を分子が吸収します。その後、図では黒色の矢印で示された光を発しない緩和過程(溶媒などに熱エネルギー等の形でエネルギーを渡し、エネルギ...続きを読む

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 セルを超音波洗浄器で洗って、バラバラにしたこともあります。セルは、私にとっては、実験の最初の失敗。以後、失敗は数知れずですが、・・・。

>じゃあそれ以外で石英セルのほうがいい理由は?
正解は、「石英セルのほうがいいではなく、石英セルでないと・・・」です。
 http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/sel01.html
 石英セルは、可視部も紫外部も通します。ガラスセルでは、可視部は通すが、紫外部はほとんど通さないようです。ですから、石英セルで可視部を測るのは測定上は適正なのですが、破損の可能性を考えて(石英セルは1個1万円、ガラスセルは3000円ほどでした)、可視部はガラスセル使用というのが現実的です。
 当時は、石英セルには、セルの上部にスリガラスの線が入っているものが石英セルでした。今は違うようですが。

 「セルが壊れました」と実習学生が持ってきてくれると、『福沢諭吉がヒラヒラと飛んでいく』ことになります。貧乏な研究室の教員としては『実習をまじめにしなければ壊れることも無い』と思いつつも、顔は引きつりかけます。学生実習は、結果が分かりきっているので、当然プラスチックでしています。しかし、紫外部の測定に適したプラスチックセルは無いようで、「測定可」とした製品も文字のとおり可の状態で、石英セルのレベルではないとの業者の回答でした。

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参考URL:http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/sel01.html

 学生時代に酵素の精製をしていて、「ゼロ合わせができません」と先生に言って大恥をかいた記憶があります。酵素ですから、測定波長は280nmです。40年も前のことですから、プラスチックセルはありません。研究上での恥のかき始めなので、今でも鮮明に覚えています。
 セルを超音波洗浄器で洗って、バラバラにしたこともあります。セルは、私にとっては、実験の最初の失敗。以後、失敗は数知れずですが、・・・。

>じゃあそれ以外で石英セルのほうがいい理由は?
正解は、「石英セルのほうがいいではなく...続きを読む

Q励起スペクトル測定の意義

今、実験で蛍光と燐光について学習しているのですが励起スペクトルを測定する意義がいまいち理解出来ずにいます。

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> 600nmの光を照射し、励起スペクトルの動向を調べるのではないのかな?

ではなくて,600 nm の発光を検出しつつ,励起光の波長を変えるのが励起スペクトル.
単純に吸収したエネルギーがそのまま発光に回るなら,吸収スペクトルと一致するようなスペクトルになりそうですが,励起準位によっては吸収したからといって,それがそのまま発光に回るとは限らないわけです.どの吸収がその発光に効くのか,吸収スペクトルとかと比較すると発光機構等のてがかりになることもある,と.

Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
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オキシドールの成分に 過酸化水素(H2O2)2.5~3.5W/V%含有と記載されています。W/V%の意味が分かりません。W%なら重量パーセント、V%なら体積パーセントだと思いますがW/V%はどのような割合を示すのでしょうか。どなたか教えていただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。

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Q『励起スペクトルと発光スペクトルが一致する』って?

『励起スペクトルと発光スペクトルが一致する』って、表現ありますよね。

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m(_ _)m

Aベストアンサー

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Q境膜について

温度境膜について、
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 境膜はレイノルズ数で結構変化します。特に層流と乱流では大きく変ります。

Q定性分析と定量分析の違い

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例えば、必要とされる条件とか。何でも良いですのでおしえてください!

Aベストアンサー

「定性分析の方が難しい」とは限りません。それは「何を指して」定性分析と
呼ぶか(採用する分析手法・装置も含め)の違いによります。

「元素分析」を例に取ると、原子吸光光度計による「定性分析」は、特定の
元素対応のホローカソードランプを取っ替え引っ替えしないといけませんから、
大変です。しかし、ICP発光やICP-MSでは全く事情が異なります。ICPでは
(感度は別にして)ほとんど全ての元素を一度に分析できます。この場合、
"定性分析"として検出可能な濃度下限は「検出下限」と呼ばれます。
これに対し、「その元素がどれだけの量含まれているか」の定量分析が
できる濃度下限は「定量下限」と呼ばれます。通常、

  定量下限>検出下限

です。このため、一般に"定量分析"の方が濃度的に大きなものを必要とする
ので、ある対象について、

  定性分析はできても、定量分析はできない

ということが起こります(当然"ある濃度以下である"ということは言えますが)。
もちろん、再現性などの観点でも、定量分析の方が要求されるものが多く
なります。

「定性分析の方が難しい」とは限りません。それは「何を指して」定性分析と
呼ぶか(採用する分析手法・装置も含め)の違いによります。

「元素分析」を例に取ると、原子吸光光度計による「定性分析」は、特定の
元素対応のホローカソードランプを取っ替え引っ替えしないといけませんから、
大変です。しかし、ICP発光やICP-MSでは全く事情が異なります。ICPでは
(感度は別にして)ほとんど全ての元素を一度に分析できます。この場合、
"定性分析"として検出可能な濃度下限は「検出下限」と呼ばれます。
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