培養細胞へのトランスフェクション時の培養ボリューム

ヒトの培養細胞を使ってsiRNA実験(メーカーによりすでに効果が確認されているコントロールsiRNA)を行っているのですが、96穴プレートでは効果が低い(40～50％減)のですが、48穴プレートでは効果が高い(70～80％減)傾向があります。おそらくトランスフェクション効率の問題だと思うのですが、培養ボリュームによって差が出ることってあるのでしょうか。培地、試薬、細胞数は同じロットのものをウェルの培養面積の変化と同じ割合で量を変えています。プレートのメーカーは違うのですが表面加工は同じです。トランスフェクション後48時間で見てます。細胞はHepG2です。そんなに使いにくい細胞ではないと思うのですが。

また以前に行ったルシフェラーゼアッセイのプラスミドを入れる実験でも同じように培養ボリュームでトランスフェクション効率が変わるような印象をもっています。このときもHepG2ですが。

おそらくどこか実験系にミスがあるのだろうとは思うのですが、どこをどうしたらよいのかわかりません。

培養ボリュームの違いによる結果の違いについて、同じような経験をされた方、聞いたことがある方、何かご存知でしたら教えてください。

No.1 回答者： baba-san 回答日時： 2005/12/26 20:18

Lipofectamine2000などの試薬によるtransfectionは細胞密度に依存しますが、細胞密度はdishの違いでそろっているでしょうか？

Lipofectamine2000の場合sub-confluentがいいと聞きます。

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
巻き込む細胞数はdish(well)の培養面積に比例して変えているので、細胞密度は同じはずなのですが。
そのあたりもう一度確認する必要があるのかもしれません。

お礼日時：2005/12/27 10:41

No.2 回答者： fujishiro 回答日時： 2005/12/26 20:42

蒔くときの数が同じでも、継代数が違ったりすると増殖スピードが変わって、細胞の密度が変わったりすることがありますよ。

また、96穴プレートなどでは偏りやすいですし。

HepG2を使ったことがないのでわかりませんが、中には小さな多穴プレートで飼うと密度は同じでも増殖スピードや感度が変わる細胞もありますし、shRNAを入れる前に一度、じっくり観察してみてはいかがでしょうか。

この回答へのお礼

継代数は1、2回違うだけなので、そんなに変わるのかどうかわかりませんが確認が必要ですね。
「小さな多穴プレートで飼うと密度は同じでも増殖スピードや感度が変わる」場合があるのですか。
おっしゃるようにHepG2ではどうなのか観察が必要ですね。
そのあたりの増殖スピードや形態(顔つき？)の変化を観察するが不慣れなためかどうも私には難しいのですが。

ありがとうございました。

お礼日時：2005/12/27 10:52

No.3 回答者： bzxjpjp 回答日時： 2005/12/26 23:54

私も、トランスフェクション効率が原因だと思います。

解決策になるかわかりませんが、トランスフェクションした細胞を再度96ウエルプレートにまきなおすというのはどうでしょうか？
あとは、No.2さんがおっしゃっていること（特に偏り）が考えられると思います。

この回答へのお礼

なるほど、まき直すとは思いつきませんでした。
ただ、合成したsiRNAをトランスフェクションしているだけなので、その抑制効果がいつまでもつのかが心配です。トランスフェクション後に薬剤耐性を見たいので、まき直したりしても大丈夫なのか。
参考にさせていただきます。

ありがとうございました。

お礼日時：2005/12/27 10:58

No.4 回答者： ga111 回答日時： 2005/12/27 06:48

ウエルの垂直壁に近づけば、表面張力で液面があがります。

よって、単純に試薬量を面積あたりで計算すると深さが場所によってかなり違ってきます。（細胞をまくときも然り。）最少量の試薬を使うと、かなり条件がかわるでしょう。

これを検証するには、単一のトランスフェクション溶液をつくり、これまでの液量とその倍量などを条件を振り、例の２種のプレートをつかって実験すればわかるかも。

実験系にミスがあるのではなく、単純に１種のプレートを使えばいいのかもしれません。

この回答へのお礼

ありがとうございます。
試薬の濃度は基本的に同じなのですが、培地の深さというのも重要な因子なのでしょうか？難しいですね。

試薬のコストや効率の関係で96穴プレートを使いたいと思い、試薬量、細胞数など条件を振って何度かやってみたのですが抑制効果が見られず、もしやと思って48穴プレートでやってみたところ、特別に条件を振ったわけでもないのですが、一発でうまくいってしまいまして。"ボリュームアップするとうまくいく"説が出てきてしまった次第です。
できれば96穴プレートで進めたいのですか。

お礼日時：2005/12/27 11:43

No.5 ベストアンサー 回答者： walkinoctopus 回答日時： 2005/12/31 12:15

もう回答も複数寄せられているようですので、私も思いつくことをいくつか。

ポイントになるのはやはりトランスフェクション効率、というか細胞密度が原因だと思います。
実験をしていると感じていると思いますが、96-well plateで均一に細胞をまくことは結構難しく、どうしても中心に寄ってしまうからです。
siRNAを行う際、検体数の多いときは私も96-well plateを予備実験に使うことはありますが、本データは6-well plate以上の大きさでやっています。理由は96-wellでは均一にまくことが難しく、細胞密度が高くコンフルエントな中心部分ではトランスフェクション効率が下がり、結果がばらつくからです。もちろん、コストも飛躍的に上がりますが(笑)　どうしても、多穴プレートでやる場合は、wellの外周部分にピペットで滴下するように細胞をまき（中心部にはまかない）、揺らさないようにするのが、コツといえばコツでしょうか。何回かやってみるとある程度は改善されますが、やはり10cm dishのような均一さを出すのは難しいです。

また、トランスフェクション効率そのものを確認したいのでしたら、蛍光のついたsiRNAなんかを購入してトランスフェクションするのも一つの方法です。細胞をばらして顕微鏡で観察すればどの程度の細胞に導入されているかが視覚的に確認することができます。

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
お礼遅くなりすみません。

細胞のまき方、確かに意外と難しいです。
ボリュームアップすればいいのでしょうが、どうも貧乏性で。
でも結局何回もおんなじ実験やるから高くつくのかもしれないですね。

お礼日時：2006/01/11 19:27