はじめまして

電気泳動の失敗例を探しています。

自分のバンドが何故でなかったのか
調べてるのですが…
分子量マーカーはちゃんとでたので
ゲルの問題ではないと思います。

出たのは「靄」みたいなので…ーー;

実験は

アガルースゲルの大腸菌を制限酵素で切断
エチシウムブロマイドで色を着け(色ではありませんが)
UVで照射し撮影しました。

どなたがご存知の方
よろしくお願い致します。

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A 回答 (4件)

制限酵素のSTAR活性かもしれません。


STAR活性のある制限酵素(EcoRIなど)を過剰に加えたり、反応時間が長すぎたり(オーバーナイトなど)すると、認識部位以外でも切断が起こって、DNAが靄状(スメア)になります。
経験者。
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この回答へのお礼

投稿での情報の少なさにお詫び致します。
今回は大腸菌のプラスミドを制限酵素
(Hind・III)で切断し、
込みこんでいるものと、いないプラスミドを両方抽出し、アガロースで電気泳動しその差を
見るものでした。

実験は2回目で、一人でするのが初めてです
前回はマウスの臓器の分子量をポリアクリルアミド
で見ました。

印刷されたゲルは、私のみた感じでは
影も形もありません、靄があるだけです

いかがでしょう?

お礼日時:2005/04/14 20:44

典型的な学生実験ですね。



制限酵素処理したサンプルとしていないサンプル。
どちらもバンドが見えないのですか?
だとすればDNAの抽出に失敗した可能性が非常に高いです。

靄のバンドの大きさはどの程度ですか?
ベクターの大きさのところでしょうか?
バンドとしてもっとも濃くでるのは
ベクターか挿入断片です。
どの大きさのところにバンドが出てくる可能性があるかは
実験の内容を考えればわかるはずです。
その位置にありますか?
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こんにちは。



バンドがでない理由としては,

1.分子量。試料がなんらかの原因で壊れてしまい,分子量が小さくなってしまっているために,あるべきところにバンドがでない。(試料のだいたいの分子量はわかっていて,ゲル濃度や分子量マーカーを選んでいるのですよね。)

2.試料の濃度が低い。

>出たのは「靄」みたいなので…
微妙に見えるということなのでしょうか?だとしたら,濃度が低いのだと思いますが。

UV照射はやったことがないので,あまり詳しくありませんが,バンド位置を確認するだけでしたら,UVを強く?(波長を変えられませんでしたっけ?)してみてはいかがでしょう。ただし,その後ゲルを使って何かするのであれば,UVによって分子が壊れてしまうので,位置確認のためだけのゲルを作る事をお勧めします。

電気泳動前の実験に問題があることも考えれますけど。電気泳動は初めてなのですか?だとしたら,操作ミスってことも考えられます。何回もやればコツがわかってきますよ。頑張って下さい。
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こんばんわ。


質問の意味をよく理解できなかったのですが・・・

実験ですが、「大腸菌から取ったプラスミドDNAを制限酵素処理し、アガロースゲルを用いて電気泳動した」ということでしょうか?
そうであれば・・・
制限酵素処理に用いたプラスミドDNAが十分な量なかったのでは?
電気泳動に用いるサンプル量が極端に少ないと、モヤがかかったようなバンドがでることはあります。

他の可能性としては、制限酵素処理中にDNaseがコンタミしてしまい、DNAが断片化してしまった場合にも、モヤがかかったようになる時があったような気が・・・

お役にたてたかどうか・・・??
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Aベストアンサー

sarurujiさんこんにちは。
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この後、これらをどう分けるべきか悩んでいます。
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Aベストアンサー

BlueやRedなどの基質特異性の低いアフィニティクロマトを使ってみてはどうでしょうか。

クロマトを行う前に、少量の試料と担体で、バッチ法により吸着と溶出条件を確認するのがよいと考えます。たとえ、目的とする酵素が吸着しなくても、他のタンパク質が吸着されて、担体を通過させるだけで、純度が上がると言うこともあります。

なお、実験の際には、必ず温度条件も考慮しましょう。
私がアルドースリダクターゼの精製に、先の担体を使用したときには、室温と低温(4℃)で吸着性が全然違いました。
論文を書く段になって、そのことに気づき、温度をコントロールすれば、もっと純度が上がったはずなのにと、後悔したことがあります。


蛇足ですが、

>分子量60Da付近のタンパクが3種出てきました。

とありますが、60kDaの間違いでないですか、タンパク質にしては、異常に分子量が低いような気がするのですが(それとも、私の学生時代とは、単位の桁が変わったのでしょうか)。
ちなみに、分子量の測定は、どのように行ったのでしょうか? SDS-PAGE or ゲルろ過

以上、ご参考になればよいのですが。

参考URL:http://www.tosoh.co.jp/hp_inx.htm

BlueやRedなどの基質特異性の低いアフィニティクロマトを使ってみてはどうでしょうか。

クロマトを行う前に、少量の試料と担体で、バッチ法により吸着と溶出条件を確認するのがよいと考えます。たとえ、目的とする酵素が吸着しなくても、他のタンパク質が吸着されて、担体を通過させるだけで、純度が上がると言うこともあります。

なお、実験の際には、必ず温度条件も考慮しましょう。
私がアルドースリダクターゼの精製に、先の担体を使用したときには、室温と低温(4℃)で吸着性が全然違いました。
論文を...続きを読む


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