電気泳動の失敗

はじめまして

電気泳動の失敗例を探しています。

自分のバンドが何故でなかったのか
調べてるのですが…
分子量マーカーはちゃんとでたので
ゲルの問題ではないと思います。

出たのは「靄」みたいなので…ーー；

実験は

アガルースゲルの大腸菌を制限酵素で切断
エチシウムブロマイドで色を着け（色ではありませんが）
ＵＶで照射し撮影しました。

どなたがご存知の方
よろしくお願い致します。

No.3 ベストアンサー 回答者： overthisgraysky 回答日時： 2005/04/14 15:14

制限酵素のSTAR活性かもしれません。

STAR活性のある制限酵素（EcoRIなど）を過剰に加えたり、反応時間が長すぎたり（オーバーナイトなど）すると、認識部位以外でも切断が起こって、ＤＮＡが靄状（スメア）になります。
経験者。

この回答へのお礼

投稿での情報の少なさにお詫び致します。
今回は大腸菌のプラスミドを制限酵素
（Ｈｉｎｄ・III）で切断し、
込みこんでいるものと、いないプラスミドを両方抽出し、アガロースで電気泳動しその差を
見るものでした。

実験は２回目で、一人でするのが初めてです
前回はマウスの臓器の分子量をポリアクリルアミド
で見ました。

印刷されたゲルは、私のみた感じでは
影も形もありません、靄があるだけです

いかがでしょう？

お礼日時：2005/04/14 20:44

No.4 回答者： mizu_atsu 回答日時： 2005/04/15 22:05

典型的な学生実験ですね。

制限酵素処理したサンプルとしていないサンプル。
どちらもバンドが見えないのですか？
だとすればDNAの抽出に失敗した可能性が非常に高いです。

靄のバンドの大きさはどの程度ですか？
ベクターの大きさのところでしょうか？
バンドとしてもっとも濃くでるのは
ベクターか挿入断片です。
どの大きさのところにバンドが出てくる可能性があるかは
実験の内容を考えればわかるはずです。
その位置にありますか？

No.2 回答者： assay 回答日時： 2005/04/13 22:14

こんにちは。

バンドがでない理由としては，

1．分子量。試料がなんらかの原因で壊れてしまい，分子量が小さくなってしまっているために，あるべきところにバンドがでない。（試料のだいたいの分子量はわかっていて，ゲル濃度や分子量マーカーを選んでいるのですよね。）

2．試料の濃度が低い。

＞出たのは「靄」みたいなので…
微妙に見えるということなのでしょうか？だとしたら，濃度が低いのだと思いますが。

UV照射はやったことがないので，あまり詳しくありませんが，バンド位置を確認するだけでしたら，UVを強く？（波長を変えられませんでしたっけ？）してみてはいかがでしょう。ただし，その後ゲルを使って何かするのであれば，UVによって分子が壊れてしまうので，位置確認のためだけのゲルを作る事をお勧めします。

電気泳動前の実験に問題があることも考えれますけど。電気泳動は初めてなのですか？だとしたら，操作ミスってことも考えられます。何回もやればコツがわかってきますよ。頑張って下さい。

No.1 回答者： osarut 回答日時： 2005/04/13 22:07

こんばんわ。

質問の意味をよく理解できなかったのですが・・・

実験ですが、「大腸菌から取ったプラスミドDNAを制限酵素処理し、アガロースゲルを用いて電気泳動した」ということでしょうか？
そうであれば・・・
制限酵素処理に用いたプラスミドDNAが十分な量なかったのでは？
電気泳動に用いるサンプル量が極端に少ないと、モヤがかかったようなバンドがでることはあります。

他の可能性としては、制限酵素処理中にDNaseがコンタミしてしまい、DNAが断片化してしまった場合にも、モヤがかかったようになる時があったような気が・・・

お役にたてたかどうか・・・？？