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はじめまして

電気泳動の失敗例を探しています。

自分のバンドが何故でなかったのか
調べてるのですが…
分子量マーカーはちゃんとでたので
ゲルの問題ではないと思います。

出たのは「靄」みたいなので…ーー;

実験は

アガルースゲルの大腸菌を制限酵素で切断
エチシウムブロマイドで色を着け(色ではありませんが)
UVで照射し撮影しました。

どなたがご存知の方
よろしくお願い致します。

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A 回答 (4件)

制限酵素のSTAR活性かもしれません。


STAR活性のある制限酵素(EcoRIなど)を過剰に加えたり、反応時間が長すぎたり(オーバーナイトなど)すると、認識部位以外でも切断が起こって、DNAが靄状(スメア)になります。
経験者。
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この回答へのお礼

投稿での情報の少なさにお詫び致します。
今回は大腸菌のプラスミドを制限酵素
(Hind・III)で切断し、
込みこんでいるものと、いないプラスミドを両方抽出し、アガロースで電気泳動しその差を
見るものでした。

実験は2回目で、一人でするのが初めてです
前回はマウスの臓器の分子量をポリアクリルアミド
で見ました。

印刷されたゲルは、私のみた感じでは
影も形もありません、靄があるだけです

いかがでしょう?

お礼日時:2005/04/14 20:44

典型的な学生実験ですね。



制限酵素処理したサンプルとしていないサンプル。
どちらもバンドが見えないのですか?
だとすればDNAの抽出に失敗した可能性が非常に高いです。

靄のバンドの大きさはどの程度ですか?
ベクターの大きさのところでしょうか?
バンドとしてもっとも濃くでるのは
ベクターか挿入断片です。
どの大きさのところにバンドが出てくる可能性があるかは
実験の内容を考えればわかるはずです。
その位置にありますか?
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こんにちは。



バンドがでない理由としては,

1.分子量。試料がなんらかの原因で壊れてしまい,分子量が小さくなってしまっているために,あるべきところにバンドがでない。(試料のだいたいの分子量はわかっていて,ゲル濃度や分子量マーカーを選んでいるのですよね。)

2.試料の濃度が低い。

>出たのは「靄」みたいなので…
微妙に見えるということなのでしょうか?だとしたら,濃度が低いのだと思いますが。

UV照射はやったことがないので,あまり詳しくありませんが,バンド位置を確認するだけでしたら,UVを強く?(波長を変えられませんでしたっけ?)してみてはいかがでしょう。ただし,その後ゲルを使って何かするのであれば,UVによって分子が壊れてしまうので,位置確認のためだけのゲルを作る事をお勧めします。

電気泳動前の実験に問題があることも考えれますけど。電気泳動は初めてなのですか?だとしたら,操作ミスってことも考えられます。何回もやればコツがわかってきますよ。頑張って下さい。
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こんばんわ。


質問の意味をよく理解できなかったのですが・・・

実験ですが、「大腸菌から取ったプラスミドDNAを制限酵素処理し、アガロースゲルを用いて電気泳動した」ということでしょうか?
そうであれば・・・
制限酵素処理に用いたプラスミドDNAが十分な量なかったのでは?
電気泳動に用いるサンプル量が極端に少ないと、モヤがかかったようなバンドがでることはあります。

他の可能性としては、制限酵素処理中にDNaseがコンタミしてしまい、DNAが断片化してしまった場合にも、モヤがかかったようになる時があったような気が・・・

お役にたてたかどうか・・・??
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Q電気泳動でバンドが出ない理由(学生実験)

Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。

大腸菌のコロニーに
TE/RNaseA

NaOH(アルカリ変性させた)

NaOAc(中性に戻した 大腸菌のゲノム:ニックが入ってもとに戻らない、プラスミド:元に戻る)

phenol/chlorophorm(ph層:大腸菌のゲノム  水層:プラスミドをふくむ)

水層をとりだしてisopropannol加える

ethanol(洗浄)
の順で操作を行った後、電気泳動しました。

しかし、私がやったサンプルはバンドがだいぶ薄くなってしいました。
その理由がわからず悩んでおります。

予想としては、phenol/chlorophormをいれて遠心をかけて油層と水層にわけたときに、二つの層の間に白い層(タンパク質が含まれているらしい層)があり、水層(プラスミド含)を取り出す際にそれをピペットで吸ってしまったことが原因だったのかな、と思っているのですが、その根拠などもわかりません。

どなたかわかる方がいらっしゃいましたら、教えてくださると幸いです。

Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。

大腸菌のコロニーに
TE/RNaseA

NaOH(アルカリ変性させた)

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phenol/chlorophorm(ph層:大腸菌のゲノム  水層:プラスミドをふくむ)

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ethanol(洗浄)
の順で操作を行った後、電気泳動しました。

しかし...続きを読む

Aベストアンサー

バンドが薄くても検出されてるなら、学生実験ならまぁOKではないでしょうか。

 原因としては、エタノール沈澱洗浄の際、プラスミドまで吸ってしまったり、あるいはもともとサンプルに極端にプラスミドが少なかったりしたこと、あるいは上清分離の際にプラスミドあるいはゲノムの層を取る量が少なかったなどが挙げられるのではないでしょうか。

 あるいは電気泳動の際に、希釈でミスしてたりも考えられます。

 ご検証ください。

 

Q電気泳動の原理について

今大学で電気泳動を盛んにしているのですが、いまさらながら電気泳動の原理や、なぜしているのかなどがいまいちよくわかりません・・・バンドがでてきますが、何を表しているのかもいまいちです。。情けない限りなのですが、どなたか教えていただけるとありがたいです。染色体地図をかいてくるとういう課題もでているのですが、電気泳動の意味がよくわかっていない自分には手のつけようのない課題なのです。どうかお願いします。

Aベストアンサー

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すなわち、泳動後に現れるバンドは、大きさのまとまった断片の集まりということになります。

まず、DNAは核酸という酸であるということはご存知のことと思います。
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つまり、電気を流すとプラスの方へ流れていくことになります。
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QPCRの失敗について

PCR後電気泳動したんですが、
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Aベストアンサー

>PCRってちゃんと溶液を混ぜてもできないことあるん
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Aベストアンサー

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Q電気泳動のスメアバンド

DNAを電気泳動をしたときに、バンドが一本ではなく、スメアになることがあると思います。スメアバンドは様々なサイズのDNAが存在するために、見かけ上スメアになると思っていたのですが、ほんとうのサイズより遥かに大きなサイズと思われるところまで、スメアなバンドが広がっていたりします。また、スメアなバンドをゲルから回収して再精製して泳動してみると、違ったサイズにでたりすることもあります。
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Aベストアンサー

エチジウムブロマイドは二本鎖の核酸において塩基間にもぐりこむように結合します。そのため、2本鎖のRNA・DNAが染色されます。そのほかにはゴミとかとも結合したりしますがスメア状にはならず、ぽつぽつとした点状に光ります。
PCRにはdNTP・プライマー・テンプレート(DNAとRNA)・DNAポリメラーゼ・bufferが含まれており、反応後になると上記の残留物に加えて増幅産物が含まれるようになります。
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それと私がキットといっているのはまさにそのフィルターのことです。おそらく、断片化するのは物理的な影響によるものと思いますが、詳しくは販売している会社に問い合わせてください。いろいろと製品ごとの特性がありそうですから。それと製品によって生成できるサイズが異なりますのでそちらは説明書を読んでください。私はキアゲン派でしたがそんなに大きなサイズのものは生成できなかったと思いますよ。

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QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

QDNA電気泳動で困ったことが起こっています。

DNA電気泳動で困ったことが起こっています。
環状プラスミドの状態では目的バンドよりも2000bpくらい低い位置にバンドが現れるので、
おかしいおかしいと騒いでいたのですが、制限酵素処理をすると、正しい位置にバンドが現れ
ます。
これってどういう現象なのでしょうか。
経験のある方いらっしゃいますか。

ちなみに、制限酵素処理の何が影響しているのがわからなかったので、
(1)ただ単にサンプルを37℃でインキュベートしたもの、 
(2)サンプルにH-buffer(Bam/Eco用)を加え、37℃インキュベートしたもの
(3)サンプルにH-buffer,BamHI,EcoRIを加え、37℃でインキュベートしたもの
(4)TEに溶解しているDNAをインキュベート無しのもの
と、並べて泳動した結果、(3)のみバンドの位置が正しく、他は2000bp程度低かったです。
環状と鎖状の違いでしょうか。
まったく分からなくて困っています。

Aベストアンサー

非常に初歩的、常識的な現象です。
無傷のプラスミドは、スーパーコイル(supercoil)あるいはccc (covalently closed circular)と呼ばれる状態を取ります。これはプラスミド全体がぞうきんを絞り上げるようにねじれ上がって、コンパクトになっているので、同じ分子量の線形のDNAよりゲル電気泳動での移動度が大きくなります。泳動条件(バッファー組成、EtBrの有無など)やプラスミドの種類やサイズにもよりますが、移動度はおおよそ線形の倍くらいです。

cccにニック(二重鎖のある位置で、片側鎖のみ切れる)が生じると、OC (open circular)という状態になります。これは環状構造は保たれているけれど、スーパーコイルにはならず広がっています。分子の嵩が大きくなるので移動度は小さくなり、通常、同じ分子量の線形DNAよりやや遅くなります。

ウェブ検索すれば、このような解説や、泳動像の例は無数に見つかると思います。

formの異なるDNA同士では、移動度に基づいて分子量の比較はできません。
通常、分子量マーカーは線形なので線形DNAの分子量推定しかできません。
特殊な製品として、ccc プラスミドのサイズラダーなんかもあります。

非常に初歩的、常識的な現象です。
無傷のプラスミドは、スーパーコイル(supercoil)あるいはccc (covalently closed circular)と呼ばれる状態を取ります。これはプラスミド全体がぞうきんを絞り上げるようにねじれ上がって、コンパクトになっているので、同じ分子量の線形のDNAよりゲル電気泳動での移動度が大きくなります。泳動条件(バッファー組成、EtBrの有無など)やプラスミドの種類やサイズにもよりますが、移動度はおおよそ線形の倍くらいです。

cccにニック(二重鎖のある位置で、片側鎖のみ切れる)が...続きを読む

QSDS電気泳動について教えて下さい。

SDS電気泳動ってどういうものなのでしょうか?
検索してみるとタンパク質の変性を加えて用いるということは分かったのですが、
それ以外のことは分かりません。
どなたか詳しい方教えて下さい。 

Aベストアンサー

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲルの「網目」を通過させる(大きいサイズほど流れにくく、小さいサイズのタンパク質は流れやすい)
というものです。網目を通過しやすいかしにくいかでタンパク質の長さを測定します。結果として、ゲルの下の方には小さいタンパク質が、上の方には大きいタンパク質がきます。

SDSで変性させる理由ですが、タンパク質を直鎖状にすることです。タンパク質はその機能を発揮するために特有の立体構造(疎水結合やジスルフィド結合などを利用して)を形成します。タンパク質をそのまま泳動すると、ポリアクリルアミドゲルの「網目の通りやすさ」はタンパク質の長さだけに影響されず、タンパク質の形状(立体構造)にも影響を受けます。

SDS-PAGEを行う場合の多くは、タンパク質の長さだけを知りたいので、タンパク質の立体構造に影響される電気泳動は望ましくありません。そこで、SDSでタンパク質を直鎖状にして電気泳動します。

では、SDSをいれるとなぜ、タンパク質が直鎖状になるか、です。SDSは親水基と疎水基の両方をもつ化合物です。そして、その親水基は負(マイナス)に荷電しています。

タンパク質の立体構造はアミノ酸残基(アラニン、グリシン、リジン、トリプトファン・・・)の性質(特にアミノ酸残基がもつ電荷)の影響を大きく受けます。SDSがタンパク質に作用すると、SDSの疎水基側がタンパク質に親水基側が溶媒側に結合します。このタンパク質に結合したSDSの親水基(マイナスに荷電)がタンパク質を構成する様々なアミノ酸の特性を打ち消してしまいます。結果として、SDSが結合したタンパク質はアミノ酸残基の影響をうけられなくなり直鎖状になります。

また、このようにSDSが結合したタンパク質はマイナスに荷電しますので、電気泳動をするとタンパク質(とSDSの複合体)はマイナスからプラスの方へ泳動されていきます。

最後に、立体構造に大きな影響を与えるジスルフィド結合に関してです。このジスルフィド結合はSDSによって壊されません。そこで、多くのSDS-PAGEを行う場合は、SDSと共に2-mercaptoethanolやDTTといったジスルフィド結合を壊す還元剤で処理したタンパク質を電気泳動します。

なお、立体構造も含めて解析したい場合は、Native PAGEと呼ばれる方法で電気泳動を行います。

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲ...続きを読む

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
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