中小企業の働き方改革をサポート>>

アガロースゲル電気泳動を行ってDNAやPCR産物のバンドを検出する際に、アプライしたサンプルやマーカーが泳動中にゲルから浮き出てしまい、解析できないことがしばしばあります。

dyeはBPBを使用していて、100Vで30分ぐらい泳動していますが、10分ぐらいでゲルに青色のバンドが全く残っていないという現状です。
バッファーは1×TBE,ゲルも1×TBEで1~2%アガロースゲルを通常毎回作成して使用しています。
サンプルの精製度が悪ければ浮いてくるという話は聞いたことがありますが、マーカーも浮いてきてしまうので原因が全くわかりません。
ほかの人は同じマーカーを使用していてもこのような現象はないということです。
ゲルの作成方法に問題があるのかと考えましたが、全くわかりません。

考えられる原因をいろいろと教えていただければ、大変助かります。
どうぞよろしくお願い致します。

このQ&Aに関連する最新のQ&A

A 回答 (3件)

サンプルをエタ沈した後なら、エタノールを完全に乾燥させないと


泳動バッファー中に拡散してしまいます。
もしくはdyeの濃度が低すぎる?
dyeはグリセロールと混ぜてサンプルを沈殿させるので
グリセロールの濃度が低すぎると泳動バッファー中に
拡散してしまいますよ。
    • good
    • 0
この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
私も助言いただいたことは一度考えたのですが、マーカーも浮いてきてしまうので、他の原因である可能性が高いです。
もちろん上記のことは確認してみました。

お礼日時:2007/11/29 21:15

泳動槽やゲルが水平に置かれていないのかもしれません。


ゲルが前傾していると、水平に移動するサンプルはやがてゲルから抜け出てしまいます。
加えて、泳動バッファーをたっぷり入れすぎていませんか。バンドのシャープさや泳動時間短縮のため、ゲルの高さぎりぎりくらいにするのがベターですが、それを守っていればゲルが斜めになっているのもすぐわかります。
    • good
    • 0
この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
確かに、バッファーは多めに入れているので、ゲルの高さぎりぎりにしてもう一度挑戦してみたいと思います。

お礼日時:2007/11/27 22:18

他の人がうまくいっているのであれば、他の人のやっているのをみせてもらい、さらに自分がやっているのをみてもらうのがよいと思われます。



ちなみに、アプライしたときは浮いてこないんですか?
泳動中にとのことでしたら、もしかしたらゲルの形が影響しているのかもしれません。前にゲルをケチって少なめに作ったところ、両端のゲル厚と真ん中のゲル厚との差がかなりできてしまい、泳動中にほとんど流れ出てしまったことがあります。

この回答への補足

回答ありがとうございます。
一度ほかの人がやっているのを見たことがありますが、特に私の方法とは変わりないように見えました。。。
アプライしたときは浮いてこなく、ゲルもどちらかというと厚めに作成しています。

補足日時:2007/11/27 00:52
    • good
    • 1

このQ&Aに関連する人気のQ&A

お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!

このQ&Aを見た人が検索しているワード

このQ&Aと関連する良く見られている質問

Q電気泳動の失敗

はじめまして

電気泳動の失敗例を探しています。

自分のバンドが何故でなかったのか
調べてるのですが…
分子量マーカーはちゃんとでたので
ゲルの問題ではないと思います。

出たのは「靄」みたいなので…ーー;

実験は

アガルースゲルの大腸菌を制限酵素で切断
エチシウムブロマイドで色を着け(色ではありませんが)
UVで照射し撮影しました。

どなたがご存知の方
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

制限酵素のSTAR活性かもしれません。
STAR活性のある制限酵素(EcoRIなど)を過剰に加えたり、反応時間が長すぎたり(オーバーナイトなど)すると、認識部位以外でも切断が起こって、DNAが靄状(スメア)になります。
経験者。

Qエチジウムブロマイドについて

まったくの初心者なので・・・・・。
泳動後のゲルの染色についてお尋ねしたいのですが、
アガロースゲルでDNAを泳動した後、エチジウムブロマイドで染色しようと思っています。その時のエチジウムブロマイドの適当な濃度と染色時間を知りたいです。本によって濃度が 様々であり 困ってます。
誰か教えて下さい。宜しくお願いします。

Aベストアンサー

kimwipeさんとdora1さんとほぼ同様です。私は後染めですが、EtBrは10mg/mlで遮光室温でストックしており、水200mlに2mlを加えています。別に用事調整ではなく、何度か使いまわしています(捨てるのに手間がかかりますので)。5分程度シェーカーの上で置いて、その後数回水洗いです。写真を撮る場合、キムワイプ等で水気を切ってから撮っています。ただ、すぐに撮るとバックが強く出る感じがあるので、10分程度おいてから撮っています。ただし、置きすぎるとバンドがぼけます。kimwipeさんがおっしゃるとおり、ゲルにあらかじめEtBrを加えておくと、きれいにバンドが染まるし、泳動中にUVで確認できますが、EtBrが陰極か陽極側に(忘れました)寄るので、ゲルの濃度とバンドの位置によってはバンドとバックが重なるかもしれません。

Q電気泳動のスメアバンド

DNAを電気泳動をしたときに、バンドが一本ではなく、スメアになることがあると思います。スメアバンドは様々なサイズのDNAが存在するために、見かけ上スメアになると思っていたのですが、ほんとうのサイズより遥かに大きなサイズと思われるところまで、スメアなバンドが広がっていたりします。また、スメアなバンドをゲルから回収して再精製して泳動してみると、違ったサイズにでたりすることもあります。
スメアバンドの起こる原因やスメアバンドの正体、また、なにかスメアバンドについての情報など、ご教授よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

エチジウムブロマイドは二本鎖の核酸において塩基間にもぐりこむように結合します。そのため、2本鎖のRNA・DNAが染色されます。そのほかにはゴミとかとも結合したりしますがスメア状にはならず、ぽつぽつとした点状に光ります。
PCRにはdNTP・プライマー・テンプレート(DNAとRNA)・DNAポリメラーゼ・bufferが含まれており、反応後になると上記の残留物に加えて増幅産物が含まれるようになります。
この中での二本鎖の核酸成分は増幅産物・テンプレートDNA・テンプレート中のRNAが二本鎖を形成したもの、プライマー同士が反応したプライマーダマーです。RNAやプライマーダマーは一般的に低分子領域にスメアとして現れます。また、PCR反応液にテンプレートを入れすぎるとこれもまた電気泳動上に現れます。サンプルの状態によってはスメア状に出ることもあります。
それと私がキットといっているのはまさにそのフィルターのことです。おそらく、断片化するのは物理的な影響によるものと思いますが、詳しくは販売している会社に問い合わせてください。いろいろと製品ごとの特性がありそうですから。それと製品によって生成できるサイズが異なりますのでそちらは説明書を読んでください。私はキアゲン派でしたがそんなに大きなサイズのものは生成できなかったと思いますよ。

エチジウムブロマイドは二本鎖の核酸において塩基間にもぐりこむように結合します。そのため、2本鎖のRNA・DNAが染色されます。そのほかにはゴミとかとも結合したりしますがスメア状にはならず、ぽつぽつとした点状に光ります。
PCRにはdNTP・プライマー・テンプレート(DNAとRNA)・DNAポリメラーゼ・bufferが含まれており、反応後になると上記の残留物に加えて増幅産物が含まれるようになります。
この中での二本鎖の核酸成分は増幅産物・テンプレートDNA・テンプレート中のRNAが二本鎖を形成したもの、プライ...続きを読む

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Qアガロースゲル電気泳動でサンプルがウェルにスタック

PCR産物(2.5kb)の確認のためにアガロースゲル電気泳動を行っています。しかし、サンプルがウェルにスタックしてしまって、うまく流れてきません。マーカーはきれいに流れています。マグネシウム濃度を振ってPCRをしたのですが、マグネシウム濃度が高いサンプルほどウェルの付近ははっきりと光っているので、実はPCRはうまくいっているのではないかと考えています。どうやったらきれいに流すことができるのか教えてください。また、PCR産物をPCR-purification kitなどで精製して流すと改善されたりするのでしょうか?

Aベストアンサー

おそらくPCRのかけすぎ(テンプレート量やサイクル数が過剰)。
PCR産物がある程度増えた状態で、さらにサイクルを続けると、産物同士のミスアニールから伸長してどんどん長い産物ができます。ひどいときはお書きになったようにウェルにスタックするほど巨大化します。
Mgが多い方が増幅しやすい(反面ノンスペもでやすい)ので、Mg濃度の高い方がはっきり見えたんでしょう。

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Qアガロースゲル電気泳動におけるPCR産物バンドの乱れ

 600 bpくらいのDNA配列をPCRで増やし、その産物をPEG沈して精製しているのですが、PCR直後の電気泳動(1.5% TBE gel)では1本のバンドなのですが、PEG沈後の電気泳動では2本になっています。
 分子量で見ると、産物のバンド(600 bp)に加えて、450bp程度のバンドが新たに出現します。精製中に分解したのでしょうか?(でも、DNaseのコンタミだったらもっとズタズタに切れますよね)。それとも、精製過程で産物の一部が何か高次構造のようなものをとって、電気泳動上で二本になって見えるのでしょうか?
 原因についてご存知の方、あるいは同じ経験をされた方、教えてください。

Aベストアンサー

kohitsujikaiさん、こんにちは。

kohitsujikaiさんは、gel厚、緩衝液の量に気を使っておられるのでしょうか?

想像するに以下の条件で泳動していませんか?
泳動槽:サブマリン型
ゲル厚:4mm以上(結構厚めに作成)
緩衝液量:ゲルが沈むくらい(タプタプ?)
染色:後染めで30-60min程

もし、以上の条件で泳動されているならゲルの上面と下面で泳動に差が生じていることが考えられます。
(側面から見るとバンドが斜めになっていて、染色液の浸透が不十分なためバンドの上面側と下面側が染まっている状態です。このため上方から見ると2本のバンドに見える。)

今度、泳動・染色を行ったとき泳動方向にゲルを切断し、側面から観察してみてください。

Qバンドが消えた...

今までばっちりバンドが出ていたPCRで、突然バンドが出なくなってしまいました。
試薬、サンプル、サイクラーを変えても出ません。
泳動後、エチブロで染色してUV下で見ると、ゲルの穴からスメアーのようになっています。
PCRはnestedまで行っています。
原因がわからず大変困っています。
どうかアドバイスをお願いします。

Aベストアンサー

>ゲルの穴からスメアーのようになっています。

サイクル数が過剰で、PCR産物の重合が起こったときの症状のように思われます。サイクル数(特にnested PCRの)を減らしてみたらどうでしょう。
これまでその条件でOKだったのに、急におかしくなったというところはなぞですが、なにかの加減で今までより増えがよくなったため、これまでの反応条件ではやりすぎになってしまったのかも。

Q電気泳動の時のゲル、マーカーetcについて…

アガロースゲル電気泳動において、1%ゲルと2.5%を選択する時の基準は何でしょうか?

またゲルにアプライする時、sampleを何μ、6×loading buffer を何μ~などの組成がどうしたら良いのか分かりません。
先日学校の授業で、『sampleを0.5μ、6×loading bufferを1μ、TAEを4.5μ混ぜてアプライして』と先輩に言われましたが、何でか聞けずで。。。しかもこの前はTAEを混ぜなかったのに…と個人的に思いました。

その時、分子量マーカー100bpと500bpをアプライしたのですが、『100bpマーカーは3μと6μ、500bpは6μアプライして』と言われたのですが、何故100bpを3μと6μで分けてアプライしたのかが分かりませんでした。

どなたかご丁寧に教えていただけないでしょうか。
宜しくお願い致しますm(__)m

Aベストアンサー

アガロース濃度によって、分離に適したDNAサイズの範囲が異なります。
簡単に言うと、目的のDNAサイズが長いほど低濃度に、短いほど高濃度にします。
http://clontech.takara-bio.co.jp/product/catalog/010001006.shtml

ある濃度のゲルの分離範囲に対して短い過ぎるDNAや長すぎるDNAは、サイズの違いによる移動度の違いが出にくくなって、近接するサイズのバンド同士の分離が悪くなったり、バンドがぼやけてしまったりします。

6x loading bufferの6xとは、6倍希釈して終濃度が1xになるようにして使うべし、ということです。
5 uLのサンプル溶液にたいして1 uL加えるとその状態になります。
0.5 uLのサンプルには、0.1 uLでは液量が少なすぎて扱いづらいですから、4.5 uLの1x TAEを加え5 uLにしたところに1 uLの6x loading bufferを加えたわけですね。
このようにサンプル体積が少ないときによくやるのは、あらかじめ適当なバッファーで希釈した1x loading bufferを適当量(アプライに適した量)サンプルに加える方法です。それでは正確に1xにならないじゃないかと思われるかもしれませんが、loading bufferは多くの場合バッファー成分は含まれず、比重を高めるためだけなので厳密に1xでなくてもかまいません。

加えるのは1x TAEではなくても、たとえばTEなどの低塩濃度の中性付近のバッファであれば何でもいいです。ただし、水で希釈するのは、バッファリングが不十分になって移動度が変わってしまうことがあるので避けます。

マーカーの量を変えて複数アプライする理由としては、異なる量のマーカー(既知量)をのせておいて、これとサンプルDNAの染色強度を比較することによってサンプルのDNA量を推定するため、ということがあります。

アガロース濃度によって、分離に適したDNAサイズの範囲が異なります。
簡単に言うと、目的のDNAサイズが長いほど低濃度に、短いほど高濃度にします。
http://clontech.takara-bio.co.jp/product/catalog/010001006.shtml

ある濃度のゲルの分離範囲に対して短い過ぎるDNAや長すぎるDNAは、サイズの違いによる移動度の違いが出にくくなって、近接するサイズのバンド同士の分離が悪くなったり、バンドがぼやけてしまったりします。

6x loading bufferの6xとは、6倍希釈して終濃度が1xになるようにして使うべ...続きを読む

Q電気泳動でバンドが出ない理由(学生実験)

Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。

大腸菌のコロニーに
TE/RNaseA

NaOH(アルカリ変性させた)

NaOAc(中性に戻した 大腸菌のゲノム:ニックが入ってもとに戻らない、プラスミド:元に戻る)

phenol/chlorophorm(ph層:大腸菌のゲノム  水層:プラスミドをふくむ)

水層をとりだしてisopropannol加える

ethanol(洗浄)
の順で操作を行った後、電気泳動しました。

しかし、私がやったサンプルはバンドがだいぶ薄くなってしいました。
その理由がわからず悩んでおります。

予想としては、phenol/chlorophormをいれて遠心をかけて油層と水層にわけたときに、二つの層の間に白い層(タンパク質が含まれているらしい層)があり、水層(プラスミド含)を取り出す際にそれをピペットで吸ってしまったことが原因だったのかな、と思っているのですが、その根拠などもわかりません。

どなたかわかる方がいらっしゃいましたら、教えてくださると幸いです。

Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。

大腸菌のコロニーに
TE/RNaseA

NaOH(アルカリ変性させた)

NaOAc(中性に戻した 大腸菌のゲノム:ニックが入ってもとに戻らない、プラスミド:元に戻る)

phenol/chlorophorm(ph層:大腸菌のゲノム  水層:プラスミドをふくむ)

水層をとりだしてisopropannol加える

ethanol(洗浄)
の順で操作を行った後、電気泳動しました。

しかし...続きを読む

Aベストアンサー

バンドが薄くても検出されてるなら、学生実験ならまぁOKではないでしょうか。

 原因としては、エタノール沈澱洗浄の際、プラスミドまで吸ってしまったり、あるいはもともとサンプルに極端にプラスミドが少なかったりしたこと、あるいは上清分離の際にプラスミドあるいはゲノムの層を取る量が少なかったなどが挙げられるのではないでしょうか。

 あるいは電気泳動の際に、希釈でミスしてたりも考えられます。

 ご検証ください。

 


人気Q&Aランキング

おすすめ情報