細胞培養中の継代でのトリプシン処理について、改善方法を教えてください。

現在、接着系ヒト癌細胞を使っております。

継代の際に、容器中培養液の1/5量のトリプシン/EDTAを添加して、3分インキュベートしてから、同量の培養液を入れて、ピペッティングして細胞を剥がしております。
しかし、なかなかプレートから細胞が剥がれず、インキュベート時間を長くしたり、セルスクレーパーを用いたりして無理やり剥がしてみたのですが、細胞塊が増えるだけで、細胞がバラバラになってくれません。

遠心をして、トリプシン溶液を除いて培養液中でピペッティングしても細胞塊状態で、細胞がバラバラになってくれません。

現在、他に教えていただく方がおりませんので、ご教授よろしくお願いいたします。

No.3 ベストアンサー 回答者： sachihappy777 回答日時： 2007/01/19 13:43

こんにちは。

PBSにCaははいってはいませんか？

細胞が古い状態だとトリプシン処理をしてもはがれにくくなることがあります。
継代数はどうですか？
継代数が進んでいるようであればストックをおこしてみるのも手です。

それと、トリプシンを使わずにPBS（－）を加えて4℃で15分から30分おいてピペッティングではがすという方法があるようです。
（私はやったことはありませんが、以下の掲示板でみかけました）

参考URLですが日本組織培養学会の細胞培養に関する質問掲示板です。
過去スレを検索するとなにかみつかるかも・・

参考URL：http://jtca.dokkyomed.ac.jp/JTCA/QA/index-SS.html

この回答への補足

すみません、先ほどの回答へのお礼の訂正になります。

通常、トリプシンを添加する前に培養液を吸引して、PBSで洗浄してと段階を踏むようですが、そこでPBSの洗浄を行っておりません。
培養液を完全に吸引して、即トリプシン/EDTAを入れております。

補足日時：2007/01/19 14:25

この回答へのお礼

ありがとうございます。

癌細胞の場合でも継代数が関係するものなのでしょうか？
いろいろなことを試していたので、その中でも特にトリプシンに対して強い細胞が残って継代されてきた、なんてことも考えられるものなのでしょうか？

ちなみに継代数は１０回ほどです。

掲示板を教えてくださりありがとうございました。
早速、いろいろ検索してみようと思っております。

お礼日時：2007/01/19 14:11

No.7 回答者： rimgojam 回答日時： 2007/01/21 01:05

私は、いつも継代をする時には、PBSで一回洗ってからトリプシンをいれています。

PBSの洗浄は必須だと思っていました。
PBSで洗ってもはがれないときは、一回凍結するといいですよ。

この回答へのお礼

ありがとうございました。

やはり面倒でもPBS洗浄を行うべきなのでしょうか。
トリプシンに対する血清のトリプシンインヒビターとしての効果割合みたいなものは数値としてわかっているものなのでしょうか？

例えば、トリプシンの効果・５＝血清のトリプシンインヒビターとしての効果・１が同じで、効果が相殺されるみたいなものです。

ご教授ありがとうございました。

お礼日時：2007/01/22 23:15

No.6 回答者： ebikichi 回答日時： 2007/01/21 00:02

使用しながらの３ヶ月保存は無理です。

１ヶ月で活性が半分に落ちるように感じます。
私は小分けにして冷凍保存　一度解凍したら使用期限を１週間としていました。


しつこい細胞は　フラスコの側面ではなくて　底面をベシッ！とたたくと　思いの外　剥れてくれます。（フラスコを割らない程度に）

この回答へのお礼

ありがとうございました。

これからはトリプシンはもっと小分けにして、使用するようにします。
今まで、フラスコの底を、デコピンの要領でペシペシ弾いていたのですが、もっとベシッとたたくようにしてみます。

今日は前回のトリプシン量を増やして行ったので、うまくいきました。
ご教授ありがとうございました。

お礼日時：2007/01/22 22:21

No.5 回答者： sachihappy777 回答日時： 2007/01/19 17:13

No.3です。

PBSで洗浄を行わないと培養液中の血清がトリプシンインヒビターの
役割をしてしまいますので一度PBSによる洗浄を行ってみてはいかがでしょうか？

この回答への補足

ありがとうございました。

先ほど、会議の前に時間が無くなり、大急ぎで通常の３倍量のトリプシン溶液を加えてしまったところ、綺麗に細胞がはがれてくれました。
これはこれで、細胞にダメージがあるのかもしれませんので、改良が必要かもしれませんが、今後はトリプシン溶液を増やしてみようと思います。

補足日時：2007/01/19 19:32

この回答へのお礼

PBSにて一旦洗浄する件、さっそく来週にでも試してみようと思います。
あと、トリプシン溶液も新しいものを作製してみるのも手なのかもと思いました。

この度はご教授ありがとうございました。

お礼日時：2007/01/19 19:37

No.4 回答者： yoshimura1977 回答日時： 2007/01/19 15:50

剥がれにくい細胞であればトリプシン処理の前のPBSwashは必要かと思います。

トリプシン以外の酵素を使ったことはありますか？
コラゲナーゼやBD社が出しているcell dissociation bufferなどはいかがでしょう。

この回答への補足

ありがとうございました。

細胞分与を受けた元では、トリプシンにてと記載がございましたので、トリプシン以外は使ったことがございません。

先ほど、会議の前に時間が無くなり、大急ぎで通常の３倍量のトリプシン溶液を加えてしまったところ、綺麗に細胞がはがれてくれました。
これはこれで、細胞にダメージがあるのかもしれませんので、改良が必要かもしれませんが、今後はトリプシン溶液を増やしてみようと思います。

補足日時：2007/01/19 19:28

この回答へのお礼

この度はご教授ありがとうございました。

お礼日時：2007/01/19 19:35

No.2 回答者： yuno2006 回答日時： 2007/01/19 12:28

古いトリプシンを使っていませんか？

私のやり方も1の方と同じです。時々タッピング（ディッシュ？を横から軽くたたく）
してます。
ピペッティングは先端を遠沈管の底にくっつけて培養液を出し入れするといいかもしれないです。

この回答へのお礼

ありがとうございます。

トリプシンは下記の条件の物で、3ヶ月くらいは使っております。
通常、経験的にトリプシンはどのくらいの期間、効果を持ち続けるものなのでしょうか？通常は４℃で保管して、使用する度に３７℃に暖めてから使っております。

細胞塊というのか、ゴムのようにブヨンブヨンしてしまって、なかなか細かくならないという状態です。
ピペッティングも底で、上でといろいろと、また太いピペットがダメなのかとパスツールを使ってみたりしているのですが、うまいこといきません。

いろいろ考えると、トリプシンが古すぎるっていうのが問題なのでしょうか？

ご指摘ありがとうございました。

お礼日時：2007/01/19 13:11

No.1 回答者： ga111 回答日時： 2007/01/19 11:59

ＰＢＳで２回洗って、トリプシン/EDTAで、３７度、でインキュベート。

５、１０分、、、と経時的に取り出して観察。はがれるまでずっとインキュベート。あまり長いと死ぬかも知れませんけど、それもチェックしてみてくださお。

この回答へのお礼

ありがとうございます。
最高、１５分まではやってみたことがあるのですが。
普通に考えると、そこまでやりすぎるないと剥がれないこと自体が問題なのかと思ってしまったのです。

お礼日時：2007/01/19 13:06