現在、接着系ヒト癌細胞を使っております。

継代の際に、容器中培養液の1/5量のトリプシン/EDTAを添加して、3分インキュベートしてから、同量の培養液を入れて、ピペッティングして細胞を剥がしております。
しかし、なかなかプレートから細胞が剥がれず、インキュベート時間を長くしたり、セルスクレーパーを用いたりして無理やり剥がしてみたのですが、細胞塊が増えるだけで、細胞がバラバラになってくれません。

遠心をして、トリプシン溶液を除いて培養液中でピペッティングしても細胞塊状態で、細胞がバラバラになってくれません。

現在、他に教えていただく方がおりませんので、ご教授よろしくお願いいたします。

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A 回答 (7件)

こんにちは。


PBSにCaははいってはいませんか?

細胞が古い状態だとトリプシン処理をしてもはがれにくくなることがあります。
継代数はどうですか?
継代数が進んでいるようであればストックをおこしてみるのも手です。

それと、トリプシンを使わずにPBS(-)を加えて4℃で15分から30分おいてピペッティングではがすという方法があるようです。
(私はやったことはありませんが、以下の掲示板でみかけました)

参考URLですが日本組織培養学会の細胞培養に関する質問掲示板です。
過去スレを検索するとなにかみつかるかも・・

参考URL:http://jtca.dokkyomed.ac.jp/JTCA/QA/index-SS.html

この回答への補足

すみません、先ほどの回答へのお礼の訂正になります。

通常、トリプシンを添加する前に培養液を吸引して、PBSで洗浄してと段階を踏むようですが、そこでPBSの洗浄を行っておりません。
培養液を完全に吸引して、即トリプシン/EDTAを入れております。

補足日時:2007/01/19 14:25
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この回答へのお礼

ありがとうございます。

癌細胞の場合でも継代数が関係するものなのでしょうか?
いろいろなことを試していたので、その中でも特にトリプシンに対して強い細胞が残って継代されてきた、なんてことも考えられるものなのでしょうか?

ちなみに継代数は10回ほどです。

掲示板を教えてくださりありがとうございました。
早速、いろいろ検索してみようと思っております。

お礼日時:2007/01/19 14:11

私は、いつも継代をする時には、PBSで一回洗ってからトリプシンをいれています。


PBSの洗浄は必須だと思っていました。
PBSで洗ってもはがれないときは、一回凍結するといいですよ。
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この回答へのお礼

ありがとうございました。

やはり面倒でもPBS洗浄を行うべきなのでしょうか。
トリプシンに対する血清のトリプシンインヒビターとしての効果割合みたいなものは数値としてわかっているものなのでしょうか?

例えば、トリプシンの効果・5=血清のトリプシンインヒビターとしての効果・1が同じで、効果が相殺されるみたいなものです。

ご教授ありがとうございました。

お礼日時:2007/01/22 23:15

使用しながらの3ヶ月保存は無理です。


1ヶ月で活性が半分に落ちるように感じます。
私は小分けにして冷凍保存 一度解凍したら使用期限を1週間としていました。


しつこい細胞は フラスコの側面ではなくて 底面をベシッ!とたたくと 思いの外 剥れてくれます。(フラスコを割らない程度に)
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この回答へのお礼

ありがとうございました。

これからはトリプシンはもっと小分けにして、使用するようにします。
今まで、フラスコの底を、デコピンの要領でペシペシ弾いていたのですが、もっとベシッとたたくようにしてみます。

今日は前回のトリプシン量を増やして行ったので、うまくいきました。
ご教授ありがとうございました。

お礼日時:2007/01/22 22:21

No.3です。


PBSで洗浄を行わないと培養液中の血清がトリプシンインヒビターの
役割をしてしまいますので一度PBSによる洗浄を行ってみてはいかがでしょうか?

この回答への補足

ありがとうございました。

先ほど、会議の前に時間が無くなり、大急ぎで通常の3倍量のトリプシン溶液を加えてしまったところ、綺麗に細胞がはがれてくれました。
これはこれで、細胞にダメージがあるのかもしれませんので、改良が必要かもしれませんが、今後はトリプシン溶液を増やしてみようと思います。

補足日時:2007/01/19 19:32
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この回答へのお礼

PBSにて一旦洗浄する件、さっそく来週にでも試してみようと思います。
あと、トリプシン溶液も新しいものを作製してみるのも手なのかもと思いました。

この度はご教授ありがとうございました。

お礼日時:2007/01/19 19:37

剥がれにくい細胞であればトリプシン処理の前のPBSwashは必要かと思います。


トリプシン以外の酵素を使ったことはありますか?
コラゲナーゼやBD社が出しているcell dissociation bufferなどはいかがでしょう。

この回答への補足

ありがとうございました。

細胞分与を受けた元では、トリプシンにてと記載がございましたので、トリプシン以外は使ったことがございません。

先ほど、会議の前に時間が無くなり、大急ぎで通常の3倍量のトリプシン溶液を加えてしまったところ、綺麗に細胞がはがれてくれました。
これはこれで、細胞にダメージがあるのかもしれませんので、改良が必要かもしれませんが、今後はトリプシン溶液を増やしてみようと思います。

補足日時:2007/01/19 19:28
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この回答へのお礼

この度はご教授ありがとうございました。

お礼日時:2007/01/19 19:35

古いトリプシンを使っていませんか?



私のやり方も1の方と同じです。時々タッピング(ディッシュ?を横から軽くたたく)
してます。
ピペッティングは先端を遠沈管の底にくっつけて培養液を出し入れするといいかもしれないです。
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この回答へのお礼

ありがとうございます。

トリプシンは下記の条件の物で、3ヶ月くらいは使っております。
通常、経験的にトリプシンはどのくらいの期間、効果を持ち続けるものなのでしょうか?通常は4℃で保管して、使用する度に37℃に暖めてから使っております。

細胞塊というのか、ゴムのようにブヨンブヨンしてしまって、なかなか細かくならないという状態です。
ピペッティングも底で、上でといろいろと、また太いピペットがダメなのかとパスツールを使ってみたりしているのですが、うまいこといきません。

いろいろ考えると、トリプシンが古すぎるっていうのが問題なのでしょうか?

ご指摘ありがとうございました。

お礼日時:2007/01/19 13:11

PBSで2回洗って、トリプシン/EDTAで、37度、でインキュベート。

5、10分、、、と経時的に取り出して観察。はがれるまでずっとインキュベート。あまり長いと死ぬかも知れませんけど、それもチェックしてみてくださお。
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この回答へのお礼

ありがとうございます。
最高、15分まではやってみたことがあるのですが。
普通に考えると、そこまでやりすぎるないと剥がれないこと自体が問題なのかと思ってしまったのです。

お礼日時:2007/01/19 13:06

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また細胞を剥がして、少しの間放置しなければならない場合、細胞に負担がかからない何か良い方法はあるのでしょうか。

ご教授お願い致します。

Aベストアンサー

「トリプシン→カウント→反応停止」ではなく、
「トリプシン→反応停止→カウント」が正しい手順です。

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十分解離したら、直ちに培地を加えるなどして反応を止めましょう。

>また細胞を剥がして、少しの間放置しなければならない場合、細胞に負担がかからない何か良い方法はあるのでしょうか。

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吸水力=内液の浸透圧-外液の浸透圧-膨圧=0 です。

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では初代培養細胞の利点は何かあるのでしょうか?

当方化学系の研究室に所属しているので身近に質問できる人がいません。なにとぞよろしくおねがいいたします。

Aベストアンサー

これをまずは見てみて下さい。
http://oshiete1.goo.ne.jp/qa4078187.html

>実験を行う上での選択の基準は何でしょうか?

自分の実験で扱いやすいと思った方を使うだけです。
この二つの細胞は、遺伝子導入が容易いので、よく使いますが、
どっちが良いのかというのは個人の判断です。

>HeLaは癌細胞由来だから癌細胞のアッセイなどに使って、HEKは正常細胞を見たいときにつかうということでしょうか?

いいえ。どちらも既に正常細胞ではありません。正常細胞はあくまで初代培養細胞です。この二つはどちらもずーっと分裂し続けます。

>あと初代培養細胞株と通常の細胞株の違いって、初代培養細胞株は培養条件や形質転換の条件が確立されていない点で扱いにくいという理解でよろしいのでしょうか?

確立されていないということはありません、ただ、効率が悪かったりします。上にあげたURLにあるように、初代培養細胞はまず集めることや、培養自体が難しいとかありますので、総合的に実験しづらいです。

>では初代培養細胞の利点は何かあるのでしょうか?

所詮、293細胞やHeLaは「細胞株」でしかありません。
試験管ではない、細胞を使った解析は出来ますが、それはあくまで
この二つの特殊な細胞でそうなるということにすぎません。
最後の決めの実験はやはり、実際の細胞ではどうなのか?ということを証明しなくてはなりません。

例えば、腸の細胞での話をしていて、最初は293細胞で実験をやっていて得られた結果を、細胞はやはり腸の細胞で証明しないとダメだということです。

293とHeLaなどの「細胞株(cell line)」は実験に使いやすい
汎用実験用細胞といった感じのものです。

これをまずは見てみて下さい。
http://oshiete1.goo.ne.jp/qa4078187.html

>実験を行う上での選択の基準は何でしょうか?

自分の実験で扱いやすいと思った方を使うだけです。
この二つの細胞は、遺伝子導入が容易いので、よく使いますが、
どっちが良いのかというのは個人の判断です。

>HeLaは癌細胞由来だから癌細胞のアッセイなどに使って、HEKは正常細胞を見たいときにつかうということでしょうか?

いいえ。どちらも既に正常細胞ではありません。正常細胞はあくまで初代培養細胞です。この二...続きを読む

Qトリプシンの活性部位

トリプシンの基質特異性と活性部位について質問をされました。
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Aベストアンサー

 まず酵素一般の基質特異性と活性部位についてですが、基本的に別物です。基質特異性に関しては鍵とカギ穴を想像してみてください。カギ穴は特定の鍵としか合致しないですよね。つまり酵素も基本的に特定の基質を認識します。トリプシンはたんぱく質を基質として特異的に結合します。

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 トリプシンはたんぱく質のペプチド結合ををはじっこから加水分解します。BANAもペプチド結合でつながっているのではじっこから加水分解されます。たぶんこのとき加水分解されて出てきた成分がトリプシンの存在を調べるために使われるのだと思います。

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また以前に行ったルシフェラーゼアッセイのプラスミドを入れる実験でも同じように培養ボリュームでトランスフェクション効率が変わるような印象をもっています。このときもHepG2ですが。

おそらくどこか実験系にミスがあるのだろうとは思うのですが、どこをどうしたらよいのかわかりません。

培養ボリュームの違いによる結果の違いについて、同じような経験をされた方、聞いたことがある方、何かご存知でしたら教えてください。

ヒトの培養細胞を使ってsiRNA実験(メーカーによりすでに効果が確認されているコントロールsiRNA)を行っているのですが、96穴プレートでは効果が低い(40~50%減)のですが、48穴プレートでは効果が高い(70~80%減)傾向があります。おそらくトランスフェクション効率の問題だと思うのですが、培養ボリュームによって差が出ることってあるのでしょうか。培地、試薬、細胞数は同じロットのものをウェルの培養面積の変化と同じ割合で量を変えています。プレートのメーカーは違うのですが表面加工は同じです。トランス...続きを読む

Aベストアンサー

もう回答も複数寄せられているようですので、私も思いつくことをいくつか。
ポイントになるのはやはりトランスフェクション効率、というか細胞密度が原因だと思います。
実験をしていると感じていると思いますが、96-well plateで均一に細胞をまくことは結構難しく、どうしても中心に寄ってしまうからです。
siRNAを行う際、検体数の多いときは私も96-well plateを予備実験に使うことはありますが、本データは6-well plate以上の大きさでやっています。理由は96-wellでは均一にまくことが難しく、細胞密度が高くコンフルエントな中心部分ではトランスフェクション効率が下がり、結果がばらつくからです。もちろん、コストも飛躍的に上がりますが(笑) どうしても、多穴プレートでやる場合は、wellの外周部分にピペットで滴下するように細胞をまき(中心部にはまかない)、揺らさないようにするのが、コツといえばコツでしょうか。何回かやってみるとある程度は改善されますが、やはり10cm dishのような均一さを出すのは難しいです。

また、トランスフェクション効率そのものを確認したいのでしたら、蛍光のついたsiRNAなんかを購入してトランスフェクションするのも一つの方法です。細胞をばらして顕微鏡で観察すればどの程度の細胞に導入されているかが視覚的に確認することができます。

もう回答も複数寄せられているようですので、私も思いつくことをいくつか。
ポイントになるのはやはりトランスフェクション効率、というか細胞密度が原因だと思います。
実験をしていると感じていると思いますが、96-well plateで均一に細胞をまくことは結構難しく、どうしても中心に寄ってしまうからです。
siRNAを行う際、検体数の多いときは私も96-well plateを予備実験に使うことはありますが、本データは6-well plate以上の大きさでやっています。理由は96-wellでは均一にまくことが難しく、細胞密度が高...続きを読む

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現在、他に教えていただく方がおりませんので、ご教授よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

こんにちは。
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こんにちは。

Helaはもともとクローン化されていないラインですし、細胞の形態は一通りではありません。培養の時期とか、FCSなどの要因によっては顔つきが変わることもあるでしょうし、全体としてみた場合の性質も変わることがあるかもしれません。それ自体は普通に起こりうることです。結果に統一性を持たせるためには、実験目的に即してpasasge数を厳密にそろえるとか、クローニングするなど考慮しましょう。


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