現在、接着系ヒト癌細胞を使っております。

継代の際に、容器中培養液の1/5量のトリプシン/EDTAを添加して、3分インキュベートしてから、同量の培養液を入れて、ピペッティングして細胞を剥がしております。
しかし、なかなかプレートから細胞が剥がれず、インキュベート時間を長くしたり、セルスクレーパーを用いたりして無理やり剥がしてみたのですが、細胞塊が増えるだけで、細胞がバラバラになってくれません。

遠心をして、トリプシン溶液を除いて培養液中でピペッティングしても細胞塊状態で、細胞がバラバラになってくれません。

現在、他に教えていただく方がおりませんので、ご教授よろしくお願いいたします。

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A 回答 (7件)

こんにちは。


PBSにCaははいってはいませんか?

細胞が古い状態だとトリプシン処理をしてもはがれにくくなることがあります。
継代数はどうですか?
継代数が進んでいるようであればストックをおこしてみるのも手です。

それと、トリプシンを使わずにPBS(-)を加えて4℃で15分から30分おいてピペッティングではがすという方法があるようです。
(私はやったことはありませんが、以下の掲示板でみかけました)

参考URLですが日本組織培養学会の細胞培養に関する質問掲示板です。
過去スレを検索するとなにかみつかるかも・・

参考URL:http://jtca.dokkyomed.ac.jp/JTCA/QA/index-SS.html

この回答への補足

すみません、先ほどの回答へのお礼の訂正になります。

通常、トリプシンを添加する前に培養液を吸引して、PBSで洗浄してと段階を踏むようですが、そこでPBSの洗浄を行っておりません。
培養液を完全に吸引して、即トリプシン/EDTAを入れております。

補足日時:2007/01/19 14:25
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この回答へのお礼

ありがとうございます。

癌細胞の場合でも継代数が関係するものなのでしょうか?
いろいろなことを試していたので、その中でも特にトリプシンに対して強い細胞が残って継代されてきた、なんてことも考えられるものなのでしょうか?

ちなみに継代数は10回ほどです。

掲示板を教えてくださりありがとうございました。
早速、いろいろ検索してみようと思っております。

お礼日時:2007/01/19 14:11

私は、いつも継代をする時には、PBSで一回洗ってからトリプシンをいれています。


PBSの洗浄は必須だと思っていました。
PBSで洗ってもはがれないときは、一回凍結するといいですよ。
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この回答へのお礼

ありがとうございました。

やはり面倒でもPBS洗浄を行うべきなのでしょうか。
トリプシンに対する血清のトリプシンインヒビターとしての効果割合みたいなものは数値としてわかっているものなのでしょうか?

例えば、トリプシンの効果・5=血清のトリプシンインヒビターとしての効果・1が同じで、効果が相殺されるみたいなものです。

ご教授ありがとうございました。

お礼日時:2007/01/22 23:15

使用しながらの3ヶ月保存は無理です。


1ヶ月で活性が半分に落ちるように感じます。
私は小分けにして冷凍保存 一度解凍したら使用期限を1週間としていました。


しつこい細胞は フラスコの側面ではなくて 底面をベシッ!とたたくと 思いの外 剥れてくれます。(フラスコを割らない程度に)
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この回答へのお礼

ありがとうございました。

これからはトリプシンはもっと小分けにして、使用するようにします。
今まで、フラスコの底を、デコピンの要領でペシペシ弾いていたのですが、もっとベシッとたたくようにしてみます。

今日は前回のトリプシン量を増やして行ったので、うまくいきました。
ご教授ありがとうございました。

お礼日時:2007/01/22 22:21

No.3です。


PBSで洗浄を行わないと培養液中の血清がトリプシンインヒビターの
役割をしてしまいますので一度PBSによる洗浄を行ってみてはいかがでしょうか?

この回答への補足

ありがとうございました。

先ほど、会議の前に時間が無くなり、大急ぎで通常の3倍量のトリプシン溶液を加えてしまったところ、綺麗に細胞がはがれてくれました。
これはこれで、細胞にダメージがあるのかもしれませんので、改良が必要かもしれませんが、今後はトリプシン溶液を増やしてみようと思います。

補足日時:2007/01/19 19:32
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この回答へのお礼

PBSにて一旦洗浄する件、さっそく来週にでも試してみようと思います。
あと、トリプシン溶液も新しいものを作製してみるのも手なのかもと思いました。

この度はご教授ありがとうございました。

お礼日時:2007/01/19 19:37

剥がれにくい細胞であればトリプシン処理の前のPBSwashは必要かと思います。


トリプシン以外の酵素を使ったことはありますか?
コラゲナーゼやBD社が出しているcell dissociation bufferなどはいかがでしょう。

この回答への補足

ありがとうございました。

細胞分与を受けた元では、トリプシンにてと記載がございましたので、トリプシン以外は使ったことがございません。

先ほど、会議の前に時間が無くなり、大急ぎで通常の3倍量のトリプシン溶液を加えてしまったところ、綺麗に細胞がはがれてくれました。
これはこれで、細胞にダメージがあるのかもしれませんので、改良が必要かもしれませんが、今後はトリプシン溶液を増やしてみようと思います。

補足日時:2007/01/19 19:28
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この回答へのお礼

この度はご教授ありがとうございました。

お礼日時:2007/01/19 19:35

古いトリプシンを使っていませんか?



私のやり方も1の方と同じです。時々タッピング(ディッシュ?を横から軽くたたく)
してます。
ピペッティングは先端を遠沈管の底にくっつけて培養液を出し入れするといいかもしれないです。
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この回答へのお礼

ありがとうございます。

トリプシンは下記の条件の物で、3ヶ月くらいは使っております。
通常、経験的にトリプシンはどのくらいの期間、効果を持ち続けるものなのでしょうか?通常は4℃で保管して、使用する度に37℃に暖めてから使っております。

細胞塊というのか、ゴムのようにブヨンブヨンしてしまって、なかなか細かくならないという状態です。
ピペッティングも底で、上でといろいろと、また太いピペットがダメなのかとパスツールを使ってみたりしているのですが、うまいこといきません。

いろいろ考えると、トリプシンが古すぎるっていうのが問題なのでしょうか?

ご指摘ありがとうございました。

お礼日時:2007/01/19 13:11

PBSで2回洗って、トリプシン/EDTAで、37度、でインキュベート。

5、10分、、、と経時的に取り出して観察。はがれるまでずっとインキュベート。あまり長いと死ぬかも知れませんけど、それもチェックしてみてくださお。
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この回答へのお礼

ありがとうございます。
最高、15分まではやってみたことがあるのですが。
普通に考えると、そこまでやりすぎるないと剥がれないこと自体が問題なのかと思ってしまったのです。

お礼日時:2007/01/19 13:06

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http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8
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参考URL:http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8

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超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

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卒業研究の実験で、ヒト肝ガン由来細胞株HepG2を扱うことになり、最近培養のトレーニングを始めました。
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結論から言って技術不足です。継代の仕方事態にそれほど問題はなさそうですが、トリプシン処理中の操作とハーベストの時に問題がありそうです。

トリプシン処理中に1分ごとに観察しているとありますが、その時の操作は慎重にトリプシン液を大きく揺らさないようにしていますか?液が揺れると特にディッシュの周りから細胞がシート状にはがれて凝集しやすくなります。

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ちなみに完全にバラバラにするのは細胞にとってあまりよくありません3~5個の塊が均一にあるのがベストです。


培養細胞をやれる環境にあるということは当然先輩たちもやっているはずですね。まずは先輩たちに聞いて、自分がやっている様子をみてもらってアドバイスをもらうことです。ここで、文章で読んでできるなら、既にできているはずですから。HepG2は凝集しやすいですが練習で改善できるでしょう。ディッシュを増やして毎日、数枚継代できる状態を作りましょう。


頑張ってください。

結論から言って技術不足です。継代の仕方事態にそれほど問題はなさそうですが、トリプシン処理中の操作とハーベストの時に問題がありそうです。

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これからいろいろな実験をする、または関連する論文を読むのかと思いますが、実験ではよく“細胞株”というものを使います。
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これからいろいろな実験をする、または関連する論文を読むのかと思いますが、実験ではよく“細胞株”というものを使います。
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結論から言うと、ケースバイケースで、万能の細胞分散法はありません。細胞塊が何の物質によって繋がっているか、によって対策が異なります。

とはいえ私の経験では、細胞塊を作りやすい培養細胞は、デスモゾームを作る上皮系細胞である場合がほとんどです。No.1の方が書かれているトリプシンは、デスモゾームを切るという点ではあまり有効ではありません。またトリプシンは二価金属イオンがあると活性が落ちるため普通PBS(-)に溶かします。そのため、トリプシン処理を長時間続けると生存率が著しく低下します。

以前私が扱っていた乳腺上皮癌由来細胞が、やはり非常に凝集塊を作りやすく、難儀をしたことがあります。フローサイトメーターにかける必要からシングルセルにしなければならなかったのですが、トリプシンではどうしても不可能でした。

このときは、無血清の増殖培地にプロナーゼを溶かし、この酵素液で40分処理して単細胞に分散させることができました。

ただこのような細胞でも、大抵コンフルエントに達する前にトリプシン処理すれば、比較的簡単に単細胞に分散させることができます。実験上許されるなら、それがベストの方法です。

結論から言うと、ケースバイケースで、万能の細胞分散法はありません。細胞塊が何の物質によって繋がっているか、によって対策が異なります。

とはいえ私の経験では、細胞塊を作りやすい培養細胞は、デスモゾームを作る上皮系細胞である場合がほとんどです。No.1の方が書かれているトリプシンは、デスモゾームを切るという点ではあまり有効ではありません。またトリプシンは二価金属イオンがあると活性が落ちるため普通PBS(-)に溶かします。そのため、トリプシン処理を長時間続けると生存率が著しく低下します...続きを読む

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ここで、ふと疑問なんですが、インキュベーター内でキャップを緩めなくてはならない場合は、アルコール消毒してからインキュベーターに入れたらよいのでしょうか?しなくてもよいのでしょうか?
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Aベストアンサー

まず下でfujishiroさんがおっしゃっている通り、培養液がコンタミしていないかを調べてみるべきだと思われます。冷蔵庫に入れてあると菌が繁殖しづらく、確認しづらいので、一日、室温に置いておきます。翌日、ビンを振ってみて白いものがユラユラとしていたらコンタミってことになります。

僕は使用する器具・試薬はすべて乾熱滅菌・オートクレーブ・ろ過滅菌を行っています。そして、たとえエタノール消毒していたとしても「手が触ったところは菌が付いている」と思ってそれらを使用しています。
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ちなみに失礼ですがkumanokophooさんは培養を始めて間もなかったリするでしょうか?始めのうちは気をつけているつもりでも、どうしてもコンタミの洗礼を受けてしまいます。でもしばらくすると慣れてきて失敗しなくなりますよ。

まず下でfujishiroさんがおっしゃっている通り、培養液がコンタミしていないかを調べてみるべきだと思われます。冷蔵庫に入れてあると菌が繁殖しづらく、確認しづらいので、一日、室温に置いておきます。翌日、ビンを振ってみて白いものがユラユラとしていたらコンタミってことになります。

僕は使用する器具・試薬はすべて乾熱滅菌・オートクレーブ・ろ過滅菌を行っています。そして、たとえエタノール消毒していたとしても「手が触ったところは菌が付いている」と思ってそれらを使用しています。
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Aベストアンサー

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宜しくお願いします!

Aベストアンサー

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