ブロッキングに使用するスキムミルクの作製方法

免疫染色を行う際のブロッキングに使用するスキムミルクの作製方法について教えてください。 現在免疫染色を行う際にブロッキング剤として森永のスキムミルクをPBSで溶解させて使用しています。しかし、2%で作製したつもりでも完全に溶けてくれないため時間をあけてから上清を取って使っています。これでは2%ですらないですよね？
スキムミルクが安価なためスキムミルクの正しいブロッキング剤の作製方法をご教授いただければと思います。
素人な質問で大変申し訳ありませんがよろしくお願いします。

No.5 ベストアンサー 回答者： Mr_Spock 回答日時： 2011/02/20 12:16

ちょっと補足しておきます。

カゼインはセリン残基が豊富で、それらが高度にリン酸化されており（リン酸化タンパク質に対する抗体のブロッキングに不適当なのはそのためです）、リン酸基がナトリウムやカルシウムと塩を作っています。カゼイン-リン酸カルシウムという、そうでなくても溶解度の低そうなものを、さらにリン酸バッファーで溶かすということは、容易でないことが想像できるでしょう。

この回答へのお礼

お礼が大変遅くなり申し訳ありませんでした。
非常に分かりやすい解説ありがとうございます。
私は、現在メインがIH、ICですが調べて問題なさそうなので
まずTBSで確認しようと思います。

お礼日時：2011/02/22 09:27

No.4 回答者： browntraut 回答日時： 2011/02/19 16:45

ANo.3さんの仰るように、PBSではなく、トリスバッファーで作るのが良いと思います。

小生もトリスにtweenを加えた、TBSTをウェスタンブロットのブロッキングに使っていたことを思い出しました。

IHやICなどの染色ではトリスはあまり使いませんが。

No.3 回答者： Mr_Spock 回答日時： 2011/02/19 11:29

ものによってはスキムミルクに含まれるカゼインが大量のカルシウムを抱合しているためか、リン酸を主成分とするリン酸バッファーには溶けにくいことがあります。

PBSの代わりにTBSを使用するか、ほかの溶媒（水、マレイン酸バッファー）などに溶解した１０％程度のストック溶液を作って、それをPBSに加えてみてはいかがでしょうか。

No.2 回答者： browntraut 回答日時： 2011/02/18 12:00

免疫染色、ウェスタンブロットでしょうか？

PBSにTweenを0.1%加えたバッファー(PBST)で2~5%になるように溶かして使います。
顆粒の溶け具合界面活性剤の影響も少なからずあるかもしれません。

溶けにくいのには原因があると思います。
経験的にはスキムミルクが開封日から過ぎるとだんだん吸湿し、玉になり、溶けにくくなるように思います。
開けたてはサラッとしていて、サッと溶けますが、メーカーにもよるのでしょうか。
一般的にはファットフリーのものが良いとされているます。
うちはコープ（生協）のものを使っていますが、問題ありません。

ちなみに、スキムミルクの固まりがあっても、ブロッキングには影響なしです。

スキムミルクにはリン脂質がたくさん入っていますので、リン酸化検出には使えません。
BSAや、ミルク成分を含まないブロッキング剤をご使用されるのが良いと思います。

No.1 回答者： overthisgraysky 回答日時： 2011/02/17 09:40

うちでは1時間くらいスターラーで攪拌させるとだいたい溶けます。