グッドデザイン賞を受賞したウォーターサーバー >>

こんにちは。
基本的なことかもしれないのですが、お願いしますm(__)m
先日、酵素反応の実験をしたのですがその際に
「ミカエリスメンテン式では、基質溶解度などの制限より最大反応速度の近似値しか分からないので、ラインウェーバー・バーク式から数値を
求める」という説明がありました。
ですが、なぜミカエリスメンテン式では近似値しか求められないのかということがよく理解できません。
どなたか、教えてください。

A 回答 (1件)

その文章はまったく正確ではありません.


基質濃度無限大の時の反応速度は現実には測定できません.なので低濃度での測定値からの外挿で求めるわけですが,基質濃度に対して反応速度をプロットしたグラフではどこが飽和収束値になるのか,あいまいにしか推定できません.一方,Lineweaver-Burk 形式でプロットすれば,直線を外挿して得たy切片を読み取ればよいので,数値を求めやすくなります.
ただし,Michaelisis-Menten の式のままでも,データに対して直接カーブフィッティングをきちんとやれば Vmax は求められます.Lineweaver-Burk プロットから求めた場合と数値はたぶん一致しませんが,それは誤差を含む測定値の統計処理の問題にすぎず,本質的には同じ値が出てきます.
しかし,カーブフィッティングが簡単にできるようになったのは,コンピュータが普及してからの話であり,昔は何らかの形で一次関数に変換して作図的に読み取るのが,精度もそこそこ高く,また計算の手間も少なかったのです.
直接的なカーブフィッティングが容易にできる現在でも Lineweaver-Burk プロットや Eadie-Hofstee プロットなどは行われますし,それを軽視してはいけないのは,Michaelisis-Menten 式に対する適合性をもっとも直感的に判断できるからです.Vmax や Km 値を求めるという観点ではすべてのやり方について統計的な意味での一長一短があり,反応速度等をどのようにはかったかという実験作業上の問題と切り離すこともできません.
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この回答へのお礼

わかりやすい回答ありがとうございます。
実習書に書いてあるような文章でも、正確じゃないこともあるのですね。
勉強になりました。
本当にありがとうございますm(__)m

お礼日時:2007/11/03 14:44

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QLineweaver-Burkプロット

基質濃度と吸光度は分かっているんですがここから
Lineweaver-BurkプロットによりKm値とVmaxを求めるやり方がわかりません。教えてください。

Aベストアンサー

ミカエルス・メンテンの式は、基質濃度[S]が一定の場合に成立します。
しかし、実験では酵素によって基質が分解されて、経時的に減少するため一定に保つことができません。
参照サイトの説明にあるように、実際は基質の分解が10%以下の条件を便宜的に用います。
たぶん実験に用いた反応時間は、基質の分解が10%以下という設定になっていると思います。
生成物のモル吸光係数がわかれば、その濃度がわかるので、基質濃度と比較すれば分解率が何%か計算できます。

で、反応速度の実験では基質の分解が10%以下の時の吸光度の増加(ΔAbs)を便宜的に「初速度」と扱います。
真の初速度は求めることができないからです。
速度には、○○/時間、の単位が必要ですから、得られた吸光度が測定時間内に直線的に増加したと考えて、
吸光度÷測定時間=ΔAbs/min (sでもhでも良い)となります。
また生成物の濃度が吸光度から計算できるなら、M/minの方がベターです。

さらに聞きたいことがあれば、遠慮なく質問して下さい。

Qミカエリス・メンテン式でKmとVmaxは出せる?

次の表のデータから、酵素反応のミカエリス定数Kmと反応最大速度Vmaxを求めなさい。

基質濃度S(mM)⇒反応速度V(μM/min)
1⇒2.5
2⇒4.0

また、反応に酵素阻害剤(I)が存在したとき、次のデータが得られた。
この阻害剤の阻害様式を答えなさい。

基質濃度S(mM)⇒反応速度V(μM/min)
1⇒2.0
4⇒5.0


とありました。
ミカエリス・メンテン式を用いて
V=Vmax・S/Km+Sとすると、KmとVmaxは同時に出せない気がするのですが・・・
どうやって出すのか、わかる方、よろしくお願いします!!!

Aベストアンサー

いくつかやりかたがありますが、ちゃんと覚えておかなければなりません。

例えば、
横軸にS-1 を、縦軸にV-1 をとってプロットすれば直線になる(ラインウィーバー・バーク プロット)事を利用して求めることが出来ます。

くわしくは、あなたが持っている教科書を読みなおしましょう。

Wikipediaの“ミカエリス・メンテン式”を見るだけでも、だいたい分かると思います。
阻害様式についても解説があります。

Qラインウィーバーバークのグラフの見方について

論文を読んでいたらラインウィーバーバークのグラフが出てきたのですが見方がわかりません。
(高校では化学IBしかとっていないレベルです・・・)
縦軸が1/v、横軸が1/[L-tirosinase]となっているのですが、傾きが急であればどうとかあるのでしょうか?

回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

Lineweaver-Burk Plotの基礎はMichaelis-Mentenの式
v=k[E]_0[S]/(Km+[S])...(1)
です。ここで[E]_0は酵素の全濃度、[S]は基質の濃度、KmはMichaelisの定数です。kは酵素基質複合体ESが生成物と酵素に分解して行くときの速度定数です。(1)式で、基質濃度[S]が、Michaelis定数Kmより圧倒的に大きいとき、反応速度は
v≒k[E]_0...(2)
で[S]に依らなくなりますが、この速度をVmaxと書きます。([S]に対してvをPlotすればvはこの値に漸近してゆくと判ります。)
Lineweaver-Burk Plotでは、縦軸が反応速度vの逆数、横軸が基質濃度[S]の逆数となります。
1/v=Km/(Vmax[S]) + 1/Vmax...(3)
これよりy切片が1/Vmaxになり、x切片が-1/Kmになることがわかります。質問者さんの聞かれている勾配はKm/Vmaxとなりますが、Michaelis-Menten式の定数はx切片、y切片から出てきます。
Kmの大きさは、[ESが原系と生成系に行く速度定数の和]/[ESが原系から生成される速度定数]ですから、これが小さいということはESの解離が起こりにくい、あるいはESが強く結びついている、ということを意味します。
ただしこのLineweaver-Burk Plotは、低基質濃度([S]が小さい時)の誤差の影響を受け易いPlotです。

Lineweaver-Burk Plotの基礎はMichaelis-Mentenの式
v=k[E]_0[S]/(Km+[S])...(1)
です。ここで[E]_0は酵素の全濃度、[S]は基質の濃度、KmはMichaelisの定数です。kは酵素基質複合体ESが生成物と酵素に分解して行くときの速度定数です。(1)式で、基質濃度[S]が、Michaelis定数Kmより圧倒的に大きいとき、反応速度は
v≒k[E]_0...(2)
で[S]に依らなくなりますが、この速度をVmaxと書きます。([S]に対してvをPlotすればvはこの値に漸近してゆくと判ります。)
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QKm値について

Km値について

Km値は基質に対する酵素の親和性だと習いました。
Km値が大きくなるほど、親和性が上がるということでしょうか。
ミカエリスメンテンのグラフからはKm値が小さくなるほうが、親和性が上がる気がするのですが。

わかる方、回答よろしくお願いいたします。

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>>Km値が大きくなるほど、親和性が上がるということでしょうか。

逆です。
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吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

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物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

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できたら、なぜそう考えられるのかという理由も一緒にお願いします。

Aベストアンサー

Vmaxは最大速度

http://ja.wikipedia.org/wiki/%E9%85%B5%E7%B4%A0
>Km と表記され「ミカエリス・メンテン定数」と呼ばれる。ミカエリス・メンテン定数とは、酵素と基質の親和性を表すパラメータであり、実測値としては酵素の最大速度の2分の1の反応速度 (Vmax/2) を有する基質濃度となる。Km 値と基質親和性の関係は以下の通りである。

Km値が低いと酵素と基質の親和性は高い(酵素と基質は相性が良い)
Km値が高いと酵素と基質の親和性は低い(酵素と基質は相性が悪い)
-------------
基質親和性が高ければ、基質濃度が低くても、Vmax/2を達成しやすくなるから。

QW/V%とは?

オキシドールの成分に 過酸化水素(H2O2)2.5~3.5W/V%含有と記載されています。W/V%の意味が分かりません。W%なら重量パーセント、V%なら体積パーセントだと思いますがW/V%はどのような割合を示すのでしょうか。どなたか教えていただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。

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w/v%とは、weight/volume%のことで、2.5~3.5w/v%とは、100ml中に2.5~3.5gの過酸化水素が含有されているということです。
つまり、全溶液100ml中に何gの薬液が溶けているか?
ということです。
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Q酵素の比活性

 前にも似たような質問をしたのですが、よく分からないのでもう一度させていただきます。
 酵素の比活性でどのようなことが分かるのでしょうか?出来れば詳しくお願いします。

Aベストアンサー

比活性というのは、タンパク質あたりの活性と定義されます。
今、アルコールを酸化する酵素を測定するために肝臓をすりつぶしたとします。肝臓には数千種類のタンパク質がありますが、その中でアルコールを酸化する酵素はごく一部です。他のタンパク質は全然別の酵素活性を持っていたり、酵素ではないタンパク質だったりします。ですから、タンパク質あたりの活性を計算すると、分母が大きいから、比活性は小さい値がでます。ところが精製操作を行って、アルコールを酸化する酵素以外のタンパク質が取り除かれれば、分母は小さくなりますから、比活性は大きくなります。その大きくなり具合は、目的の酵素以外のタンパク質を取り除く操作、つまり精製操作の指標になります。完全に精製されれば、それ以上は精製しようとしても、比活性が高くならないはずです。誰かがある酵素をすでに結晶化して、そのような純粋な酵素の比活性を報告していれば、それとの比較で、自分の行っている精製操作がよいか悪いかがわかります。
とはいっても精製した酵素が一部失活すると、たとえば、半分が失活すると、タンパク質としては全部残っていますから元の値のままですが、活性は半分になったので、比活性は半分に低下します。つまり酵素の変性による失活の指標にもなります。

比活性というのは、タンパク質あたりの活性と定義されます。
今、アルコールを酸化する酵素を測定するために肝臓をすりつぶしたとします。肝臓には数千種類のタンパク質がありますが、その中でアルコールを酸化する酵素はごく一部です。他のタンパク質は全然別の酵素活性を持っていたり、酵素ではないタンパク質だったりします。ですから、タンパク質あたりの活性を計算すると、分母が大きいから、比活性は小さい値がでます。ところが精製操作を行って、アルコールを酸化する酵素以外のタンパク質が取り除かれれ...続きを読む

Q百分率を表すこの3つ、W/V%、W/W%、V/V%…

はじめまして、お世話になります。

百分率を表すこの3つ、W/V%、W/W%、V/V%…
どれも計算方法が同じなら、細かな意味まで覚えない良いような気がしますが^^;この場合W=質量 Vは体積でなない…?

このややこしい3つを分かりやすく記してるHP、又教えてくださる方はないでしょうか。覚えにくくて…TT

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Aベストアンサー

こんにちは。WとVはそれでいいのではないでしょうか。

W/V%は、
溶液100ミリリットル中に溶質(溶けてる物)が何グラム入ってるか。

W/W%は、
溶液100グラム中に溶質が何グラム入ってるか。

V/V%は、
溶質が液体の場合に使われます。
溶液100ミリリットル中に溶質が何ミリリットル入ってるか。

という事になります。

Q酵素の反応速度論

酵素の反応速度論についての実験をしました。Lineweaver-Burk plotやHanes-Woolf plotで解析し、Vmax,Km,Kiなどを求めました。
実験中は実験をただ進めることに集中してしまい、考えていなかったのですが、これら(Vmax,Km,Ki)の値から、酵素についての何が分かり、それを酵素科学の研究などにおいてどのように活用できるのでしょうか?どなたかご教示ください。よろしくお願いします。 

Aベストアンサー

エンドポイントアッセイ(終点分析法)は目的成分と試薬を反応させて、全てを生成物に変化させたあと、吸光度の変化総量を測定して、目的成分を定量する方法です。エンドポイントに達するまでの時間は、Km値が小さく、Vmaxが大きいほど短くなります。

レートアッセイ(初速度分析法)は目的成分と試薬を反応させて、その反応が進行しているときの速度を単位時間当たりの吸光度変化量として測定し、目的成分を定量する方法です。レートアッセイは1次反応領域で吸光度変化を測定するので1次反応領域が大きい方が適しています。従って、Km値が基質濃度より十分大きい必用があります。一般的に1次反応領域は[S]≦0.05Kmです。ゆえに、レートアッセイは全ての酵素で成立するわけではありません。また、用手法での測定は困難なので、自動分析法で使用します。

自分が知ってるのは医学の分野だけなので、知識に偏りがあるかもしれません。お役に立てればいいのですが…


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