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吸光度測定の際、濃度の薄い溶液から測定するのはなぜでしょうか??

こんなふうに考えましたが正しいでしょうか??

今回の実験では測定時に同じセルを使用したため、前に測定したサンプルの濃度が影響しないようにするため。濃度の高い溶液を測定した後に濃度の低い溶液を測定すると、測定した濃度の高い溶液を低い溶液で共洗いしたとしても、希釈することができず、濃度の低い溶液の濃度が本来の測定すべき濃度よりも高くなり、大きな誤差が生じる可能性があるため適さない。一方、濃度の低い溶液から測定すれば、共洗い時に希釈が上手く行われ、誤差が生じることもほとんどないため濃度の低い溶液の測定から行う方がよい。

A 回答 (3件)

かなり時間がたっていますが回答させていただきます。



基本的にはmastarさんが考えているとおりでいいと思います。

例を挙げて説明すると、

たとえばOD値が0.050の試料と10倍濃い0.500の試料1mlがあるとします。
最初に薄いほうの0.050の試料をキュベットに1ml入れ吸光度を測定しました。
結果は0.050であることはいうまでもありませんが。測定後、キュベットから
ピペットで吸い取りました。しかし完全に回収することが難しく、10μl残って
しまいました。次に10倍濃い試料1mlを洗浄していないキュベットに入れました。
さて、結果はどうなるでしょうか。OD値 0.050の試料10μl+0.500の試料1ml
を足すと、OD値は0.496となります。誤差は0.8%でほぼないに等しく
なります。この程度なら希釈操作で簡単に出てくる誤差なのであまりきにする
必要はありません。
もし上記操作を濃い→薄いで行った場合は、0.050が0.055となってしまい、
誤差はおよそ10%も出てしまいます。
薄い→濃いの順番に測定するのはこのように誤差を少なくするためです。
これは検量線等を引くときなど常識的な操作です。
もし濃度がわからない試料を連続して測定するときは、次の試料で共洗いし
ていれば事実上全く問題ありません。
違う試料同士が混合することで反応してしまうようなものは別ですが。
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セルはちゃんと洗えばいいだけ,というかそうしなければならないので,その作法自体に意味がありません.供洗いだけですまそうなどということ自体が,不適切です.


もちろん,現場的にはそうもいってられないこともあるかもしれませんが,そもそも紫外吸収のように目視で濃淡がわからない場合などは,標準液以外は薄いほうからとか言ってられません.その場合はきちんと洗う以外にないわけです.
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コンタミの影響をできるだけおさえるためです。

この回答への補足

なぜ薄い溶液から行うとコンタミの影響を抑えられるのですか??

補足日時:2007/04/18 23:00
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また、この測定を行うとき、用いた溶液に対して最も吸光度の高いフィルターを用いました。これは、溶液の色とほぼ同じ波長のフィルターなんですよね・・・??しかし、なぜこのフィルターを用いたのかがわかりませんでした。
とても初歩的な質問ですが、回答のほどよろしくお願いします。

Aベストアンサー

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 学生時代に酵素の精製をしていて、「ゼロ合わせができません」と先生に言って大恥をかいた記憶があります。酵素ですから、測定波長は280nmです。40年も前のことですから、プラスチックセルはありません。研究上での恥のかき始めなので、今でも鮮明に覚えています。
 セルを超音波洗浄器で洗って、バラバラにしたこともあります。セルは、私にとっては、実験の最初の失敗。以後、失敗は数知れずですが、・・・。

>じゃあそれ以外で石英セルのほうがいい理由は?
正解は、「石英セルのほうがいいではなく、石英セルでないと・・・」です。
 http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/sel01.html
 石英セルは、可視部も紫外部も通します。ガラスセルでは、可視部は通すが、紫外部はほとんど通さないようです。ですから、石英セルで可視部を測るのは測定上は適正なのですが、破損の可能性を考えて(石英セルは1個1万円、ガラスセルは3000円ほどでした)、可視部はガラスセル使用というのが現実的です。
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参考URL:http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/sel01.html

 学生時代に酵素の精製をしていて、「ゼロ合わせができません」と先生に言って大恥をかいた記憶があります。酵素ですから、測定波長は280nmです。40年も前のことですから、プラスチックセルはありません。研究上での恥のかき始めなので、今でも鮮明に覚えています。
 セルを超音波洗浄器で洗って、バラバラにしたこともあります。セルは、私にとっては、実験の最初の失敗。以後、失敗は数知れずですが、・・・。

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Q検量線に吸収極大波長を用いるのはなぜですか?

Fe(II)イオンのo‐フェナントロリンキレート錯体の吸光度を測定し、横軸にFe(II)イオンの濃度、縦軸に吸光度をとって検量線を作成するという実験をおこないました。

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よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

まず、吸収極大波長を用いると感度が良くなります。よって、より低い濃度でも測定できます。
また、ノイズの影響を小さくする(SN比を大きくする)ことが出来ます。
あと、今回はおそらく関係ないかと思われますが、近い波長に吸収がさらにあると極大波長以外の場合、どちらの波長の吸光の影響が大きいか分からなくなります。


しかし、最大の原因は基本的に吸収極大波長で取るのが普通だからです。他で取ると、過去の知見を生かすことが出来ません。

Q分光光度計での測定手順

分光光度計である溶液の濃度を測定しています。
人によって二つのやり方があることが分かり、どちらが正しいかを検討しています。
ちなみにダブルビームです。
(方法1)
・キュベットAとBに水を入れてゼロ補正
・次にキュベットAにブランク、キュベットBにサンプルを入れて吸光度の差を測定する。
(方法2)
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・次にキュベットAに水、キュベットBにサンプルを入れて測定。
・ブランクとサンプルのそれぞれの吸光度の差を計算する。

どちらでも良いという人と、差があるようだという人と分かれています。どなたか教えてください。

Aベストアンサー

以前、分光光度計の設計をやっていました(早い話、作る方のプロでした)。

操作上のミスや誤差を抜きにして言えば、装置的には優位な誤差に違いは
ないように思いますが、分光光度計の設計者が想定している使用方法は、
きっと(方法1)ですね(ひょっとして私だけだったらごめんなさい)。

関係しそうなポイントをいくつか挙げておきます。

1.ゼロ補正は、再現可能性の高いものを基準として実施した方が良い。
  つまり、今日も明日も明後日も、特別なアクセサリを使用せず、
  いつものキュベットで普通の水溶液で吸光度測定をする限り(有機溶媒
  系で測定とかでなく)、試料Aを測定するにも試料Bを測定するにも、
  いつも0Absの基準は同じものにするのが望ましいです。そのためには、
  "常に同じ"蒸留水同士で取るのがベターと考えます。

2.ダブルビームの分光光度計は基本的に、サンプル溶液とブランク溶液
  の比をリアルタイムで測定することを前提に設計しています。
  (きっとどのメーカーも)

ただし、これは作る側の立場で考えていることなので、使う側の方が
「こちらの方が理屈でも経験上でも良い結果が出る」ということであれば、
決してそれを否定するものではありません。
特に、分光光度計の設計者の多くは物理屋であり、使う方々の多くはきっと
化学屋さんである点は要注意かも知れません。

以前、分光光度計の設計をやっていました(早い話、作る方のプロでした)。

操作上のミスや誤差を抜きにして言えば、装置的には優位な誤差に違いは
ないように思いますが、分光光度計の設計者が想定している使用方法は、
きっと(方法1)ですね(ひょっとして私だけだったらごめんなさい)。

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Q吸光光度法の検量線について

検量線を作成し、データーにばらつきが生じた場合はどのようにすべきなんでしょうか。無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが・・回答をお願いします。

Aベストアンサー

 検量線を引くための標準液は、0を含めて、6点取っています。標準液を調製しやすいように、例えば、0、1、2、3、4、5 mg/mlなど。これを5点検量(0は、普通対照に利用するので)と称しています。4点の場合もあります。
 基本は、グラフを書いて、1点がヅレていたら、それは無視して検量線を引く。2点ズレテイタラ、こりはヒドイので、やり直す、と言うのが教科書です。

 正確にするために検量線を2連(2回)して、その平均を取る、というバカな教えをする教員もいますが(それなら、2連より10連、100連の方が正確、と毒づいています)。
 
 実験のテクニックが難しくて、全体がばらつく場合もあります。この場合は、5点ではなく、10点とか、測定する回数を増やしたりして、信頼性を高めるしかありません。検量線は、もちろんパソコンで引きます。また、サンプルの測定も、一回だけではなく、数回測定して、平均値を去る必要があります。

 化学反応は、バラツキマセン。しかし、生物のサンプルは、個体差があるので、最低3回は測定して、平均と標準偏差を示します。例えば、血糖値を測定するときに、血液中のグルコースの測定は、ばらつかないので1回で十分。しかし、A、B、Cサンそれぞれの値は異なるので、ヒトの血糖値となると、最低3人は測定しなければなりません。
 同じサンプルを測定して、値がばらつくのは単に腕が悪いだけです。学生だと5%程度、慣れると2%以内、分析のプロだと0.5%の誤差でもウルサク言います。
データがばらつく原因を考え、検量線とサンプルの測定回数を決めてください。

>無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが
測定した点をつないだりしているのでしょうか。それはヤリマセン。昔は、測定した点の近くをなるべく通る直線(場合によっては曲線)を、慣れを頼りに引いていました。今ではパソコンがあるので、回帰式を出します。これが検量線になります。最近は、機器に検量線を自動的に描き、濃度まで計算しているのが、普通です。
 回帰式の相関係数が、0.98以上あれば信頼していますが、0.95だとやり直すかどうか迷います。

 検量線を引くための標準液は、0を含めて、6点取っています。標準液を調製しやすいように、例えば、0、1、2、3、4、5 mg/mlなど。これを5点検量(0は、普通対照に利用するので)と称しています。4点の場合もあります。
 基本は、グラフを書いて、1点がヅレていたら、それは無視して検量線を引く。2点ズレテイタラ、こりはヒドイので、やり直す、と言うのが教科書です。

 正確にするために検量線を2連(2回)して、その平均を取る、というバカな教えをする教員もいますが(それなら、2連より10連、10...続きを読む

Q吸光度のグラフ

サンプルの吸光度を測るとき5倍、10倍などに希釈して測定したならば、グラフを書くとき吸光度の値に5、10をかけた値をプロットするべきなのですか??しかし、吸光度が2を超えることはないということからすると5、10をかけると値は当然大きくなりますし...。それでも希釈率を考慮してプロットするべきなのですか?

Aベストアンサー

「吸光度が2を越えることはない」なんてことはないですよ。それを正しく測定できる機器がないというだけのことです。10倍希釈して吸光度0.4であるならばそのサンプルの吸光度は4.0です。普通は確かに予めサンプルの方を先に希釈することの方が多いですが、先に希釈するか後で希釈するかの違いであって、求める吸光度は同じであるはずです。さらに言えば、多くの場合、吸光度はそのサンプルのなんらかの濃度を求めるための手段にすぎないのであって、得られた吸光度を正しく希釈倍数乗じてやらなければ元の濃度を算出することはできません。
プロットと書いてあるので、検量線を引くための操作ならばそんな高いところを測る必要はありません。検量線とはサンプルの吸光度からその濃度を求の道具にすぎません。10倍希釈して得られたサンプルの濃度を求めるためには10倍希釈して得た吸光度を検量線に当てはめて濃度を算出し、その濃度を希釈倍数します。或いは吸光度を希釈倍数掛けて検量線を慨そうしたポイントの濃度を求めるやり方でも求まります。普通は前者のやりかたでしょうね。後者だとノートからはみ出るし、あまりかしこいやりかたではありません。

「吸光度が2を越えることはない」なんてことはないですよ。それを正しく測定できる機器がないというだけのことです。10倍希釈して吸光度0.4であるならばそのサンプルの吸光度は4.0です。普通は確かに予めサンプルの方を先に希釈することの方が多いですが、先に希釈するか後で希釈するかの違いであって、求める吸光度は同じであるはずです。さらに言えば、多くの場合、吸光度はそのサンプルのなんらかの濃度を求めるための手段にすぎないのであって、得られた吸光度を正しく希釈倍数乗じてやらなければ元...続きを読む

Q分光光度計・吸光度とは?

ある液体の濃度測定をお願いしたところ、「分光光度計にて595nmにおける吸光度を測定する」と言われました。僕にはさっぱり意味が分からず、結果の数値を見ても人に説明できません。で、分光光度計とは?吸光度とは何でしょうか?何を測定したのでしょうか?まったくの無知なもので、よろしくお願いします。

Aベストアンサー

 分光光度計とは、光源から出た光を波長ごとに分ける部分(分光部)と、分けた光を試料に当てて光の弱くなる程度を測定する部分(光度計)からなります。
 試料に当てる光の強さをXとし、試料を通過した後の光の強さをYとすると、
 まず、透過率を求めます。透過率・・・T(%)=X/Y×100
 もっとも、普通に光度計で則って居する場合、純水などをいれた空セルで100%合わせをして、次にセル内を試料に入れ替えて測定するので、透過率は装置に表示され、計算する必要はありません。
 次に、この透過率から吸光度を求めます。
 吸光度=-log(T/100)
 なぜ吸光度を計算するかと言うと、溶液中の光を吸収する成分の濃度が吸光度と比例するからです。
 予め濃度の分かった標準試料を用いて、濃度と吸光度の関係を求めて「検量線」を作っておき、その他試料の吸光度を測定する事で濃度が求められます。

 測定する色調により波長は変わります。
 検量線作成に先立って、標準試料の場合の吸収スペクトル(広い波長範囲にわたり、波長と光の吸収度の関係をグラフ化したもの)を採り、測定上最適な波長を決めます。
 普通は、光の吸収の一番大きい波長を選びますが、その他条件も加味して決定する必要は有ります。
 595nmは可視光線のやや長目の波長です。

 なお、#2さんの提示されている「Lanbert-Beerの法則」(ランバート・ベールのほうそく)は基本的かつ重要で有名な法則です。

 P.S 吸光度の計算例
 透過率=85.3%だとすると、
 吸光度=-log(85.3/100)=0.069
 (昨今の分光光度計は吸光度も自動表示されるので、いちいち計算する必要は無いのですが、原理を知っている事は大切です)
 
 

 分光光度計とは、光源から出た光を波長ごとに分ける部分(分光部)と、分けた光を試料に当てて光の弱くなる程度を測定する部分(光度計)からなります。
 試料に当てる光の強さをXとし、試料を通過した後の光の強さをYとすると、
 まず、透過率を求めます。透過率・・・T(%)=X/Y×100
 もっとも、普通に光度計で則って居する場合、純水などをいれた空セルで100%合わせをして、次にセル内を試料に入れ替えて測定するので、透過率は装置に表示され、計算する必要はありません。
 次に、この...続きを読む

QW/V%とは?

オキシドールの成分に 過酸化水素(H2O2)2.5~3.5W/V%含有と記載されています。W/V%の意味が分かりません。W%なら重量パーセント、V%なら体積パーセントだと思いますがW/V%はどのような割合を示すのでしょうか。どなたか教えていただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

w/v%とは、weight/volume%のことで、2.5~3.5w/v%とは、100ml中に2.5~3.5gの過酸化水素が含有されているということです。
つまり、全溶液100ml中に何gの薬液が溶けているか?
ということです。
w/v%のwはg(グラム)でvは100mlです。


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